Le proteine prioniche (PrP) sono molecole associate alle Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili (TSE), come la scrapie in pecora, la BSE nei bovini o il morbo di Creutzfeldt-Jacob nell’uomo (1). La PrP è una glicoproteina espressa nell’encefalo dei mammiferi, dove è legata alla membrana cellulare attraverso un’àncora di GPI (1). Alla base del ruolo svolto dalla PrP nelle “malattie da prione” c’è un meccanismo molecolare che implica la conversione dell’isoforma cellulare PrPc in PrPsc, una variante dotata di una infettività intrinseca. La PrPc ha una prevalente struttura ad α- elica con una minima quota di β -sheet, mentre la PrPsc possiede essenzialmente una struttura di tipo β (2) responsabile dell’aggregazione in oligomeri che possono evolvere nella formazione di fibra amiloide (2,3). In studi precedenti avevamo già dimostrato che la transglutaminasi microbica (mTG, enzima che catalizza la formazione di legami isopeptidici intra e/o intermolecolari fra Q e K endo-proteiche) è in grado di modificare la PrP ricombinante ovina (rPrP) introducendo dei legami intramolecolari che alterano la mobilità elettroforetica della proteina. In particolare, la forma modificata presenta una maggiore mobilità in SDS-PAGE rispetto a quella nativa. Nel presente lavoro l’attenzione è stata rivolta alla caratterizzazione della rPrP modificata. Saggi enzimatici condotti in presenza ammine primarie (che competono con le K della rPrP), quali idrossilammina, putrescina, monodansilcadaverina e spermidina hanno confermato che la modificazione della rPrP è mTGdipendente. Esperimenti di spettrometria di massa hanno permesso di rilevare la presenza di tre legami isopeptidici intramolecolari, responsabili del cambiamento conformazionale della proteina modificata che si riflette in un’aumentata mobilità elettroforetica. Il trattamento con la proteinasi K (PK) ha evidenziato che, mentre la rPrP nativa è sensibile all’azione proteolitica della PK, la forma modificata risulta resistente, comportamento tipico delle PrP ricche in struttura β (4). Per valutare se i legami introdotti dalla mTG siano in grado di alterare la cinetica di formazione della fibra amiloide, sono in corso esperimenti di aggregazione di rPrP modificata e non in cui la formazione di fibra amiloide viene monitorata mediante l’uso della Tioflavina T.
STUDI DI CARATTERIZZAZIONE DELLA rPrP OVINA MODIFICATA DALLA TRANSGLUTAMINASIMICROBICA / Sorrentino, Angela; V., Lasco; M., Fenderico; Porta, Raffaele; Mariniello, Loredana. - ELETTRONICO. - (2010), pp. 240-240. (Intervento presentato al convegno Giornate Scentifiche 2010 - Università degli Studi di Napoli "Federico II" tenutosi a Napoli nel 25-26 novembre 2010).
STUDI DI CARATTERIZZAZIONE DELLA rPrP OVINA MODIFICATA DALLA TRANSGLUTAMINASIMICROBICA
SORRENTINO, ANGELA;PORTA, RAFFAELE;MARINIELLO, LOREDANA
2010
Abstract
Le proteine prioniche (PrP) sono molecole associate alle Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili (TSE), come la scrapie in pecora, la BSE nei bovini o il morbo di Creutzfeldt-Jacob nell’uomo (1). La PrP è una glicoproteina espressa nell’encefalo dei mammiferi, dove è legata alla membrana cellulare attraverso un’àncora di GPI (1). Alla base del ruolo svolto dalla PrP nelle “malattie da prione” c’è un meccanismo molecolare che implica la conversione dell’isoforma cellulare PrPc in PrPsc, una variante dotata di una infettività intrinseca. La PrPc ha una prevalente struttura ad α- elica con una minima quota di β -sheet, mentre la PrPsc possiede essenzialmente una struttura di tipo β (2) responsabile dell’aggregazione in oligomeri che possono evolvere nella formazione di fibra amiloide (2,3). In studi precedenti avevamo già dimostrato che la transglutaminasi microbica (mTG, enzima che catalizza la formazione di legami isopeptidici intra e/o intermolecolari fra Q e K endo-proteiche) è in grado di modificare la PrP ricombinante ovina (rPrP) introducendo dei legami intramolecolari che alterano la mobilità elettroforetica della proteina. In particolare, la forma modificata presenta una maggiore mobilità in SDS-PAGE rispetto a quella nativa. Nel presente lavoro l’attenzione è stata rivolta alla caratterizzazione della rPrP modificata. Saggi enzimatici condotti in presenza ammine primarie (che competono con le K della rPrP), quali idrossilammina, putrescina, monodansilcadaverina e spermidina hanno confermato che la modificazione della rPrP è mTGdipendente. Esperimenti di spettrometria di massa hanno permesso di rilevare la presenza di tre legami isopeptidici intramolecolari, responsabili del cambiamento conformazionale della proteina modificata che si riflette in un’aumentata mobilità elettroforetica. Il trattamento con la proteinasi K (PK) ha evidenziato che, mentre la rPrP nativa è sensibile all’azione proteolitica della PK, la forma modificata risulta resistente, comportamento tipico delle PrP ricche in struttura β (4). Per valutare se i legami introdotti dalla mTG siano in grado di alterare la cinetica di formazione della fibra amiloide, sono in corso esperimenti di aggregazione di rPrP modificata e non in cui la formazione di fibra amiloide viene monitorata mediante l’uso della Tioflavina T.I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.