I sistemi cellulari dipendono da complessi multiproteici nei quali singole proteine si associano in moduli funzionali. Molti prodotti genici mediano la loro funzione all'interno di reti macromolecolari con proprietà topologiche e dinamiche che riflettono fenomeni biologici. La comprensione di meccanismi biologici e di processi patogenici richiede uno studio globale della struttura, della funzione e delle dinamiche delle reti nelle quali le stesse macromolecole funzionano. Utilizzando metodologie di biochimica, biologia molecolare e di proteomica, questa Unità mira a identificare, caratterizzare e descrivere gli interattori proteici di 1) AF4, putativo attivatore trascrizionale, noto perchè coinvolto nella patogenesi delle leucemie umane, ma anche di una forma autosomica dominante di atassia cerebellare nel topo; 2) aldolasi C, enzima glicolitico cervello-specifico, per il quale è stata ipotizzata un'attività "moonlight" in quanto i suoi livelli di espressione aumentano nel cervello di pazienti affetti da patologie del sistema nervoso centrale (SNC), lega l'mRNA neurone-specifico della catena leggera dei neurofilamenti (NF-L mRNA), e inoltre gli è stata attribuita la capacità di legare la proteina prionica. Entrambe le proteine, espresse anche nelle cellule del Purkinjie del cervelletto, sono quindi coinvolte nella patogenesi di malattie neurodegenerative. Saranno utilizzate tecnologie ad hoc (sistema del doppio ibrido, immunoprecipitazione di affinità, co-immunoprecipitazione, GST pull-down, proteomica funzionale e differenziale) per isolare i complessi macromolecolari nelle cellule che normalmente esprimono la proteina di interesse. Per AF4 saranno utilizzate le linee cellulari umane tumorali HEK293 e SKNBE, mentre la funzione dell'aldolasi C sarà valutata in tessuti di cervello di topo adulto e su tessuti di topi affetti da patologie degenerative del cervelletto. L'Unità II risolverà la struttura degli interattomi di AF4 e aldolasi C utilizzando tecniche di proteomica funzionale (elettroforesi mono e bidimensionale e MALDI-MS); questa Unità utilizzerà inoltre la proteomica di espressione (DIGE) per identificare proteine differenzialmente regolate dall'aldolasi C. L'Unità IV avrà il compito di analizzare alcune delle interazioni binarie identificate mediante una combinazione di tecniche bioinformatiche e di modelling strutturale. Per AF4, saranno analizzati eventuali domini strutturali dell'esca e di interattori specifici allo scopo di identificare i contatti diretti e definire i domini minimi di interazione. Per l'aldolasi C sarà eseguita l'analisi quantitativa e cinetica dell'interazione aldolasi C-proteina prionica cellulare mediante surface plasmon resonance (SPR). In conclusione, i risultati attesi sono: 1) isolare e risolvere la struttura del complesso di regolazione trascrizionale di cui fa parte AF4 per identificare nuovi pathway di segnalazione che potrabbero essere alterati nelle malattie neurodegenerative e nelle leucemie; 2) chiarire il significato della funzione "moonlight" dell'aldolasi C nel cervello per collegarla a meccanismi patogeneici neurodegenerativi noti o sconosciuti. Le informazioni circa il possibile ruolo di AF4 e dell'aldolasi C nei complessi biologici identificati grazie ai nostri studi potranno contribuire alla costruzione di modelli molecolari e funzionali utili per comprendere i meccanismi patogenetici alla base di alcune forme di leucemia e di neurodegenerazione.

Fisiopatologia molecolare di proteine coinvolte in pathways di regolazione genica cervello-specifica attraverso l'identificazione dei loro interattori macromolecolari / F., Salvatore; Esposito, Gabriella. - (2007). (Intervento presentato al convegno Interattomi proteici: identificazione e caratterizzazione di network cellulari in differenti condizioni fisiopatologiche nel 22-09-2008).

Fisiopatologia molecolare di proteine coinvolte in pathways di regolazione genica cervello-specifica attraverso l'identificazione dei loro interattori macromolecolari

ESPOSITO, GABRIELLA
2007

Abstract

I sistemi cellulari dipendono da complessi multiproteici nei quali singole proteine si associano in moduli funzionali. Molti prodotti genici mediano la loro funzione all'interno di reti macromolecolari con proprietà topologiche e dinamiche che riflettono fenomeni biologici. La comprensione di meccanismi biologici e di processi patogenici richiede uno studio globale della struttura, della funzione e delle dinamiche delle reti nelle quali le stesse macromolecole funzionano. Utilizzando metodologie di biochimica, biologia molecolare e di proteomica, questa Unità mira a identificare, caratterizzare e descrivere gli interattori proteici di 1) AF4, putativo attivatore trascrizionale, noto perchè coinvolto nella patogenesi delle leucemie umane, ma anche di una forma autosomica dominante di atassia cerebellare nel topo; 2) aldolasi C, enzima glicolitico cervello-specifico, per il quale è stata ipotizzata un'attività "moonlight" in quanto i suoi livelli di espressione aumentano nel cervello di pazienti affetti da patologie del sistema nervoso centrale (SNC), lega l'mRNA neurone-specifico della catena leggera dei neurofilamenti (NF-L mRNA), e inoltre gli è stata attribuita la capacità di legare la proteina prionica. Entrambe le proteine, espresse anche nelle cellule del Purkinjie del cervelletto, sono quindi coinvolte nella patogenesi di malattie neurodegenerative. Saranno utilizzate tecnologie ad hoc (sistema del doppio ibrido, immunoprecipitazione di affinità, co-immunoprecipitazione, GST pull-down, proteomica funzionale e differenziale) per isolare i complessi macromolecolari nelle cellule che normalmente esprimono la proteina di interesse. Per AF4 saranno utilizzate le linee cellulari umane tumorali HEK293 e SKNBE, mentre la funzione dell'aldolasi C sarà valutata in tessuti di cervello di topo adulto e su tessuti di topi affetti da patologie degenerative del cervelletto. L'Unità II risolverà la struttura degli interattomi di AF4 e aldolasi C utilizzando tecniche di proteomica funzionale (elettroforesi mono e bidimensionale e MALDI-MS); questa Unità utilizzerà inoltre la proteomica di espressione (DIGE) per identificare proteine differenzialmente regolate dall'aldolasi C. L'Unità IV avrà il compito di analizzare alcune delle interazioni binarie identificate mediante una combinazione di tecniche bioinformatiche e di modelling strutturale. Per AF4, saranno analizzati eventuali domini strutturali dell'esca e di interattori specifici allo scopo di identificare i contatti diretti e definire i domini minimi di interazione. Per l'aldolasi C sarà eseguita l'analisi quantitativa e cinetica dell'interazione aldolasi C-proteina prionica cellulare mediante surface plasmon resonance (SPR). In conclusione, i risultati attesi sono: 1) isolare e risolvere la struttura del complesso di regolazione trascrizionale di cui fa parte AF4 per identificare nuovi pathway di segnalazione che potrabbero essere alterati nelle malattie neurodegenerative e nelle leucemie; 2) chiarire il significato della funzione "moonlight" dell'aldolasi C nel cervello per collegarla a meccanismi patogeneici neurodegenerativi noti o sconosciuti. Le informazioni circa il possibile ruolo di AF4 e dell'aldolasi C nei complessi biologici identificati grazie ai nostri studi potranno contribuire alla costruzione di modelli molecolari e funzionali utili per comprendere i meccanismi patogenetici alla base di alcune forme di leucemia e di neurodegenerazione.
2007
Fisiopatologia molecolare di proteine coinvolte in pathways di regolazione genica cervello-specifica attraverso l'identificazione dei loro interattori macromolecolari / F., Salvatore; Esposito, Gabriella. - (2007). (Intervento presentato al convegno Interattomi proteici: identificazione e caratterizzazione di network cellulari in differenti condizioni fisiopatologiche nel 22-09-2008).
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11588/372450
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