Nuovi marcatori per stabilire ex-post l'intensità del trattamento termico nel latte del commercio.

I trattamenti termici del latte (pastorizzazione e sterilizzazione UHT) causano la denaturazione delle sieroproteine in proporzione diretta all’intensità del riscaldamento. La denaturazione termica comporta modificazioni di struttura secondaria e terziaria con formazione di aggregati proteici. Da molti anni sono stati messi in evidenza aggregati tra sieroproteine denaturate e κ-caseina con legami disolfurici. Con l’ausilio di varie tecniche analitiche (elettroforesi su gel, immunoblotting e cromatografia seguita da analisi turbidimetriche) (O’ Kennedy, B. T., et al 2006) sono stati discriminati addotti tra proteine classificati con legame “debole” (legami idrogeno) o “forte” (di tipo covalente). E’ stato possibile stabilire anche la taglia molecolare degli aggregati proteici e stimare la composizione in proteine costitutive. Recentemente gli studi si sono concentrati sulla determinazione quantitativa di proteine del siero che si denaturano in seguito a trattamenti termici di varia intensità e sulla natura degli aggregati proteici. Si sono usate le ormai note tecniche immunochimiche del tipo ELISA o l’elettroforesi seguita da densitometria (Jovanovic, S., et al 2007). Il presente lavoro di tesi parte da queste acquisizioni per spingersi più lontano nell’identificare la natura degli aggregati proteici formatisi nel latte alimentare. Un altro obiettivo è quello di quantificare le sieroproteine 34 denaturate separatamente dalle proteine solubili del latte. Per raggiungere tale obiettivo è necessario estrarre selettivamente le proteine del siero denaturate libere od impegnate in aggregati proteici e procedere alla loro identificazione. Nel presente lavoro di tesi le proteine del siero denaturate sono state identificate mediante SDS-PAGE seguita da immunoblotting con anticorpi policlonali specifici per le singole proteine. Identificazioni complementari sono state effettuate mediante cromatografia RP-HPLC in cui l’identità di ciascuna proteina è stata confermata mediante tecniche varie tra cui la spettrometria di massa MALDI-TOF. Lo studio preliminare è stato effettuato su latte alimentare sottoposto a pastorizzazione, UHT e sterilizzazione in bottiglia. Data la complessità delle situazioni, diverse da tipo di latte a tipo di latte, è stato scelto di focalizzare l’attenzione sul latte UHT per il profilo di temperatura del trattamento termico del latte, preriscaldamento a circa 80 °C/15sec., equivalente a pastorizzazione “alta” e sterilizzazione vera e propria a 145 °C/1,5sec. Data l’enorme varietà di modificazioni a cui vanno soggette le proteine denaturate, l’obiettivo minimo da raggiungere nella tesi è stato fissato nell’identificare un marcatore molecolare per almeno una significativa proteina del siero del latte che sia incorsa in sensibili modificazioni strutturali. Disponendo di tale indicatore diviene semplice stimare in termini quantitativi le proteine denaturate dal calore indipendentemente dalla natura e dal tipo di aggregato in cui esse si trovano impegnate. 35 L’indagine è stata estesa alle polveri di latte (caseinato di calcio) ed ad un preparato di proteine totali del latte. E’ stata verificata una difficoltà di frazionamento delle sieroproteine denaturate dalle caseine nelle polveri di latte a causa delle temperature elevate occorse per l’essiccazione dei prodotti. Per tale ragione è stato necessario modificare la procedura analitica valida per il latte liquido facendo ricorso alla pepsina invece che alla tripsina per la digestione enzimatica delle proteine. Lo studio è estendibile in linea teorica a tutti i derivati del latte come i formaggi ed i latti fermentati e questo costituisce al momento una delle linee di ricerca attualmente partite presso i nostri laboratori, nei quali si è iniziato a studiare la genuinità dei formaggi DOP e dei formaggi fusi per i quali è previsto l’utilizzo di latti non trattati termicamente.