L’attività svolta durante il triennio di dottorato, ha riguardato le seguenti tematiche: • Sintesi di nucleosidi e nucleotidi modificati; • Sintesi di oligonucleotidi coniugati; Lo sviluppo di una numerosa serie di reazioni e di nuove metodologie di sintesi in fase solida e di metodiche di screening sempre più veloci, sensibili ed efficienti (HTS - high-throughput screening assays) ha evidenziato negli ultimi anni le potenzialità della sintesi combinatoriale. Particolare interesse è stato rivolto, negli ultimi anni, alla sintesi di nuovi supporti solidi ancoranti “piccole molecole organiche” e al loro utilizzo per la realizzazione di librerie di molecole con potenziali attività biologiche. In tale contesto i nucleosidi rappresentano una classe di molecole di notevole interesse sia per la presenza di più gruppi funzionali, sia per le ampie applicazioni biologiche dei loro derivati. In questo lavoro di ricerca, è stata messa a punto una nuova strategia per la preparazione di supporti solidi ancoranti analoghi nucleosidici attraverso la base eterociclica. In tali supporti, a differenza di quelli commerciali, le funzioni ribosidiche sono disponibili per successive trasformazioni chimiche. La via sintetica proposta per l’ancoraggio del nucleoside alla matrice polimerica prevede la reazione di Mitsunobu tra la funzione immidica, o ammidica della base eterociclica dell’unità nucleosidica e la funzione ossidrilica della matrice polimerica derivatizzata con un opportuno linker). Con l’ausilio di tale strategia di ancoraggio è stata rivolta l’attenzione alla sintesi e all’ancoraggio ad opportuni supporti, analoghi nucleosidici (scaffold) quali la 5’-O-(4,4’-dimetossitritil) 2’-azido-3’-O-terbutildimetilsililuridina, la 5’-O-(4,4’-dimtossitrifenilmetil)-2’,3’-O-diacetil-uridina, la 5’-N-(4-metossitrifenilmetil)-ammino-5’-deossi-3’-azidotimidina. A partire da tali supporti sono stati realizzati una serie di analoghi di piccoli frammenti di acidi nucleici (NAB) molecole dalle potenziali attività antivirali, con l’ausilio di un sintetizzatore automatico di DNA Tali analoghi sono stati purificati via HPLC in fase inversa e caratterizzati mediante spettroscopia 1H-31P-NMR e ESI MS. Un notevole sforzo è stato rivolto alla sintesi di analoghi nucleosidici contenenti legami fosfodiesterei o fosforammidato; tali derivati, interessanti come profarmaci, risultano infatti solubili in acqua, stabili e meno tossici dei nucleosidi precursori. La strategia sintetica messa a punto, consente l’ottenimento degli analoghi desiderati mediante l’utilizzo di un supporto polimerico insolubile funzionalizzato con un’unità di o-clorofenolo, sul quale è incorporata l’unità nucleosidica precedentemente convertita nel corrispondente derivato fosforammidito. Una seconda fase di studi è stata indirizzata alla sintesi in fase solida di oligonucleotidi coniugati con mimici di oligosaccaridi in cui le giunzioni O-glicosidiche sono sostituite con legami ammidici. Lo scopo principale di tale metodica è quello di interfacciare e ottimizzare le procedure di accrescimento della porzione saccaromimetica con quella oligonucleotidica. Durante il triennio, a partire dalla preparazione di nuovi supporti solidi ancoranti analoghi opportunamente funzionalizzati di mono- e disaccaridi si è proceduto alla sintesi di coniugati in 3’ della sequenza GCGTGCCTCCTCACTGGC, complementare ad un tratto di mRNA codificante per la proteina chinasi A di tipo 1 (PKA1), che è superespressa nella maggior parte dei tumori. I coniugati sintetizzati sono stati caratterizzati mediante spettrometria di massa MALDI. Inoltre su tali molecole sono stati condotti studi di denaturazione termica e di stabilità chimica ed enzimatica, che hanno evidenziato per gli oligomeri coniugati stabilità e capacità di ibridizzazione con i filamenti complementari del tutto simili a quelli dei corrispondenti naturali. Un’altra fase di studi ha riguardato la sintesi di oligonucleotidi di sequenza TGGGAG coniugati con gruppi aromatici ingombranti all’estremità 5’. È noto che oligonucleotidi ricchi di guanine sono in grado di formare strutture quadruplex stabilizzate da tetradi di G. Tali strutture inusuali del DNA sono stabili in condizioni fisiologiche ed è ampiamente accettato che svolgono funzioni fondamentali in vivo, ad esempio nei telomeri. Le estremità 3’ dei cromosomi, dette telomeri, sono costituite da porzioni di DNA e da varie proteine ad esso associate; il DNA telomerico è strutturato in forma duplex ma le estremità 3’ sono costituite da filamenti ricchi di guanine, che adottano strutture quadruplex di varia tipologia. Nell’ambito di tali studi, durante il triennio di dottorato, è stata focalizzata l’attenzione sulla sintesi di sequenze TGGGAG recanti in posizione 5’ il DMT (dimetossitrifenilmetile), il TBDPSi (tert-butil difenil silile) e il DBBN (dibenzilossibenzile); inoltre, di tali sequenze, sono state studiate le relazioni struttura- stabilità.

NUOVE STRATEGIE SINTETICHE PER LOTTENIMENTO DI NUCLEOSIDI, NUCLEOTIDI ED OLIGONUCLEOTIDI MODIFICATI

DE NAPOLI, LORENZO
2005

Abstract

L’attività svolta durante il triennio di dottorato, ha riguardato le seguenti tematiche: • Sintesi di nucleosidi e nucleotidi modificati; • Sintesi di oligonucleotidi coniugati; Lo sviluppo di una numerosa serie di reazioni e di nuove metodologie di sintesi in fase solida e di metodiche di screening sempre più veloci, sensibili ed efficienti (HTS - high-throughput screening assays) ha evidenziato negli ultimi anni le potenzialità della sintesi combinatoriale. Particolare interesse è stato rivolto, negli ultimi anni, alla sintesi di nuovi supporti solidi ancoranti “piccole molecole organiche” e al loro utilizzo per la realizzazione di librerie di molecole con potenziali attività biologiche. In tale contesto i nucleosidi rappresentano una classe di molecole di notevole interesse sia per la presenza di più gruppi funzionali, sia per le ampie applicazioni biologiche dei loro derivati. In questo lavoro di ricerca, è stata messa a punto una nuova strategia per la preparazione di supporti solidi ancoranti analoghi nucleosidici attraverso la base eterociclica. In tali supporti, a differenza di quelli commerciali, le funzioni ribosidiche sono disponibili per successive trasformazioni chimiche. La via sintetica proposta per l’ancoraggio del nucleoside alla matrice polimerica prevede la reazione di Mitsunobu tra la funzione immidica, o ammidica della base eterociclica dell’unità nucleosidica e la funzione ossidrilica della matrice polimerica derivatizzata con un opportuno linker). Con l’ausilio di tale strategia di ancoraggio è stata rivolta l’attenzione alla sintesi e all’ancoraggio ad opportuni supporti, analoghi nucleosidici (scaffold) quali la 5’-O-(4,4’-dimetossitritil) 2’-azido-3’-O-terbutildimetilsililuridina, la 5’-O-(4,4’-dimtossitrifenilmetil)-2’,3’-O-diacetil-uridina, la 5’-N-(4-metossitrifenilmetil)-ammino-5’-deossi-3’-azidotimidina. A partire da tali supporti sono stati realizzati una serie di analoghi di piccoli frammenti di acidi nucleici (NAB) molecole dalle potenziali attività antivirali, con l’ausilio di un sintetizzatore automatico di DNA Tali analoghi sono stati purificati via HPLC in fase inversa e caratterizzati mediante spettroscopia 1H-31P-NMR e ESI MS. Un notevole sforzo è stato rivolto alla sintesi di analoghi nucleosidici contenenti legami fosfodiesterei o fosforammidato; tali derivati, interessanti come profarmaci, risultano infatti solubili in acqua, stabili e meno tossici dei nucleosidi precursori. La strategia sintetica messa a punto, consente l’ottenimento degli analoghi desiderati mediante l’utilizzo di un supporto polimerico insolubile funzionalizzato con un’unità di o-clorofenolo, sul quale è incorporata l’unità nucleosidica precedentemente convertita nel corrispondente derivato fosforammidito. Una seconda fase di studi è stata indirizzata alla sintesi in fase solida di oligonucleotidi coniugati con mimici di oligosaccaridi in cui le giunzioni O-glicosidiche sono sostituite con legami ammidici. Lo scopo principale di tale metodica è quello di interfacciare e ottimizzare le procedure di accrescimento della porzione saccaromimetica con quella oligonucleotidica. Durante il triennio, a partire dalla preparazione di nuovi supporti solidi ancoranti analoghi opportunamente funzionalizzati di mono- e disaccaridi si è proceduto alla sintesi di coniugati in 3’ della sequenza GCGTGCCTCCTCACTGGC, complementare ad un tratto di mRNA codificante per la proteina chinasi A di tipo 1 (PKA1), che è superespressa nella maggior parte dei tumori. I coniugati sintetizzati sono stati caratterizzati mediante spettrometria di massa MALDI. Inoltre su tali molecole sono stati condotti studi di denaturazione termica e di stabilità chimica ed enzimatica, che hanno evidenziato per gli oligomeri coniugati stabilità e capacità di ibridizzazione con i filamenti complementari del tutto simili a quelli dei corrispondenti naturali. Un’altra fase di studi ha riguardato la sintesi di oligonucleotidi di sequenza TGGGAG coniugati con gruppi aromatici ingombranti all’estremità 5’. È noto che oligonucleotidi ricchi di guanine sono in grado di formare strutture quadruplex stabilizzate da tetradi di G. Tali strutture inusuali del DNA sono stabili in condizioni fisiologiche ed è ampiamente accettato che svolgono funzioni fondamentali in vivo, ad esempio nei telomeri. Le estremità 3’ dei cromosomi, dette telomeri, sono costituite da porzioni di DNA e da varie proteine ad esso associate; il DNA telomerico è strutturato in forma duplex ma le estremità 3’ sono costituite da filamenti ricchi di guanine, che adottano strutture quadruplex di varia tipologia. Nell’ambito di tali studi, durante il triennio di dottorato, è stata focalizzata l’attenzione sulla sintesi di sequenze TGGGAG recanti in posizione 5’ il DMT (dimetossitrifenilmetile), il TBDPSi (tert-butil difenil silile) e il DBBN (dibenzilossibenzile); inoltre, di tali sequenze, sono state studiate le relazioni struttura- stabilità.
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