Negli ultimi anni sono stati proposti diversi meccanismi che potessero spiegare l’evoluzione delle proteine oligomeriche a partire dai corrispettivi monomeri, ed uno di questi è il 3D domain swapping. Con tale termine si intende un fenomeno che prevede la dislocazione di un dominio di un monomero nel corpo di un’altra subunità monomerica identica, in cui va ad occupare il posto del corrispondente tratto di catena polipeptidica. Nonostante il concetto di domain swapping sia relativamente recente in realtà il fenomeno è stato ipotizzato per la prima volta più di 40 anni fa nel caso della ribonucleasi pancreatica bovina (RNasi A), quando fu ritrovato che la proteina liofilizzata da acido acetico al 40 % formava dimeri e altri oligomeri. L’unico membro appartenente alla famiglia delle ribonucleasi esistente sotto forma di dimero in condizioni fisiologiche è la BS-RNasi, un omodimero, in cui le due subunità sono tenute insieme da due ponti disolfurici intercatena. Il dimero così formato dà luogo a due isoforme dotate di diversa struttura terziaria: in una la coda N-teminale (residui 1-15) di ciascuna catena polipeptidica interagisce con il corpo (23-124) dell’ altra subunità (MxM, o dimero scambiato), nell’ altra tale scambio non avviene e il segmento N-terminale interagisce con il corpo della propria subunità (M=M, o dimero non scambiato). In soluzione le due isoforme si interconvertono rapidamente tra di loro per raggiungere un equilibrio di 2/1 tra MxM e M=M. La proteina mostra varie singolarità biologiche tra le quali spicca una elevata attività antitumorale che sembra essere relazionabile alla sua capacità di sfuggire all’inibitore di ribonucleasi (RI). Questa attività è una proprietà peculiare della isoforma MxM: nell’ambiente riducente del citosol M=M si dissocia nelle sue due componenti monomeriche, mentre MxM rimane come dimero non covalente (denominato NCD). Questo lavoro di tesi ha previsto l’individuazione dei determinanti strutturali responsabili del fenomeno dell’interscambio di domini nelle ribonucleasi mediante mutagenesi per omologia: considerando la RNasi A come prototipo monomerico e la BS-RNasi come prototipo dimerico della famiglia delle ribonucleasi si è proceduto con la mutazione del residuo o dei residui, delle regioni principalmente coinvolte nel fenomeno, di un prototipo con i corrispondenti residui presente nella controparte. In particolare, si è posta l'attenzione sui residui localizzati nella regione cerniera (16-22), all’interfaccia aperta (Leu28) e nelle regioni che interagiscono con l’ hinge (Arg80). Tutti i dati raccolti in questo lavoro di tesi indicano che la sostituzione dei residui del peptide cerniera nella BS-RNasi non alterano, in condizioni fisiologiche, la sua propensione allo scambio, controllata invece da residui esterni a questa regione come la Leu28 e l’ Arg80. D’altro canto lo studio del domain swapping in condizioni non fisiologiche ha messo in evidenza che sostituendo i residui dell’ hinge della BS-RNasi con quelli della RNasi A, sia il dimero non covalente ottenuto per riduzione dei ponti disolfurici intersubunità di MxM sia quello ottenuto per liofilizzazione da acido acetico, mostrano una minore stabilità agli esperimenti di dissociazione termica. Sostituendo invece l’ hinge della RNasi A con i residui della BS-RNasi è possibile ottenere un dimero che ha una stabilità termica molto più alta dei dimeri formati dalla RNasi A. Il ruolo di queste mutazioni sembrerebbe essere quindi non solo quello di favorire la struttura quaternaria del dimero non covalente della BS-RNasi (NCD), cioè il dimero senza i ponti disolfurici, in grado di sfuggire all’inibitore di ribonucleasi e considerato responsabile dell’attività antitumorale dell’enzima, ma anche sfavorire una struttura simile sia a quella del dN-RNasi A sia a PM8, che anche se termicamente più stabili non sono in grado di sfuggire all'inibitore citosolico e quindi privi di quelle proprietà biologiche speciali peculiari della BS-RNasi.

STUDI STRUTTURALI DI RIBONUCLEASI RICOMBINANTI

PICONE, DELIA
2005

Abstract

Negli ultimi anni sono stati proposti diversi meccanismi che potessero spiegare l’evoluzione delle proteine oligomeriche a partire dai corrispettivi monomeri, ed uno di questi è il 3D domain swapping. Con tale termine si intende un fenomeno che prevede la dislocazione di un dominio di un monomero nel corpo di un’altra subunità monomerica identica, in cui va ad occupare il posto del corrispondente tratto di catena polipeptidica. Nonostante il concetto di domain swapping sia relativamente recente in realtà il fenomeno è stato ipotizzato per la prima volta più di 40 anni fa nel caso della ribonucleasi pancreatica bovina (RNasi A), quando fu ritrovato che la proteina liofilizzata da acido acetico al 40 % formava dimeri e altri oligomeri. L’unico membro appartenente alla famiglia delle ribonucleasi esistente sotto forma di dimero in condizioni fisiologiche è la BS-RNasi, un omodimero, in cui le due subunità sono tenute insieme da due ponti disolfurici intercatena. Il dimero così formato dà luogo a due isoforme dotate di diversa struttura terziaria: in una la coda N-teminale (residui 1-15) di ciascuna catena polipeptidica interagisce con il corpo (23-124) dell’ altra subunità (MxM, o dimero scambiato), nell’ altra tale scambio non avviene e il segmento N-terminale interagisce con il corpo della propria subunità (M=M, o dimero non scambiato). In soluzione le due isoforme si interconvertono rapidamente tra di loro per raggiungere un equilibrio di 2/1 tra MxM e M=M. La proteina mostra varie singolarità biologiche tra le quali spicca una elevata attività antitumorale che sembra essere relazionabile alla sua capacità di sfuggire all’inibitore di ribonucleasi (RI). Questa attività è una proprietà peculiare della isoforma MxM: nell’ambiente riducente del citosol M=M si dissocia nelle sue due componenti monomeriche, mentre MxM rimane come dimero non covalente (denominato NCD). Questo lavoro di tesi ha previsto l’individuazione dei determinanti strutturali responsabili del fenomeno dell’interscambio di domini nelle ribonucleasi mediante mutagenesi per omologia: considerando la RNasi A come prototipo monomerico e la BS-RNasi come prototipo dimerico della famiglia delle ribonucleasi si è proceduto con la mutazione del residuo o dei residui, delle regioni principalmente coinvolte nel fenomeno, di un prototipo con i corrispondenti residui presente nella controparte. In particolare, si è posta l'attenzione sui residui localizzati nella regione cerniera (16-22), all’interfaccia aperta (Leu28) e nelle regioni che interagiscono con l’ hinge (Arg80). Tutti i dati raccolti in questo lavoro di tesi indicano che la sostituzione dei residui del peptide cerniera nella BS-RNasi non alterano, in condizioni fisiologiche, la sua propensione allo scambio, controllata invece da residui esterni a questa regione come la Leu28 e l’ Arg80. D’altro canto lo studio del domain swapping in condizioni non fisiologiche ha messo in evidenza che sostituendo i residui dell’ hinge della BS-RNasi con quelli della RNasi A, sia il dimero non covalente ottenuto per riduzione dei ponti disolfurici intersubunità di MxM sia quello ottenuto per liofilizzazione da acido acetico, mostrano una minore stabilità agli esperimenti di dissociazione termica. Sostituendo invece l’ hinge della RNasi A con i residui della BS-RNasi è possibile ottenere un dimero che ha una stabilità termica molto più alta dei dimeri formati dalla RNasi A. Il ruolo di queste mutazioni sembrerebbe essere quindi non solo quello di favorire la struttura quaternaria del dimero non covalente della BS-RNasi (NCD), cioè il dimero senza i ponti disolfurici, in grado di sfuggire all’inibitore di ribonucleasi e considerato responsabile dell’attività antitumorale dell’enzima, ma anche sfavorire una struttura simile sia a quella del dN-RNasi A sia a PM8, che anche se termicamente più stabili non sono in grado di sfuggire all'inibitore citosolico e quindi privi di quelle proprietà biologiche speciali peculiari della BS-RNasi.
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: http://hdl.handle.net/11588/9375
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