Analysis of critical factors affecting the ovum pick-up and in vitro embryo production efficiency in buffalo species (Bubalus bubalis)

Nelle specie bufalina, l'ottimizzazione della tecnica Ovum Pick up (OPU) associata alla produzione embrionale in vitro (IVEP) è essenziale per la valorizzazione di questa risorsa animale. Attualmente, sebbene l'efficienza IVEP sia notevolmente migliorata negli ultimi anni in termini di produzioni embrionali, (Neglia et al., 2003; Gasparrini et al., 2006), la percentuale di gravidanze a termine ottenute da embrioni vitrificati, non è abbastanza alta da permettere la diffusione di questa tecnologia in campo (Neglia et al., 2004; Sá Filho et al., 2005; Hufana-Duran et al., 2004) e di conseguenza di renderla commercialmente fattibile (Gasparrini, 2010). Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare i fattori critici che influenzano l'efficienza dell’IVEP nella specie bufalina. Finora, le limitazioni principali sono: 1) la stagionalità riproduttiva della specie, 2) il basso tasso di recupero e la scarsa qualità degli oociti, (in media il 29.3% degli oociti sono classificati come vitali; Campanile et al., 2003) e 3) la ridotta qualità degli embrioni, indicata dal basso tasso di gravidanza dopo il trasferimento embrionale (ET) di embrioni crioconservati prodotti in vitro. Quindi, l'obiettivo dell’Esperimento 1 è stato quello di valutare l'effetto della stagione sulla qualità e la competenza di sviluppo degli oociti derivati da OPU. Per tale scopo, l’OPU è stato effettuato durante le diverse stagioni e la qualità degli oociti è stata valutata in termini di morfologia, mentre la competenza allo sviluppo è stata valutata in termini di percentuali di blastocisti dopo l’IVEP. I risultati dell'esperimento 1 hanno dimostrato che, anche se la qualità degli oociti, valutati in base a criteri morfologici, non è stata molto influenzata, la competenza allo sviluppo degli oociti è notevolmente migliorata in autunno rispetto ai periodi: metà-inverno e primavera-estate. Questi risultati suggeriscono di limitare il periodo di raccolta dei gameti, mediante OPU, nei mesi autunnali, al fine di risparmiare risorse e rendere il rapporto costi / benefici più favorevole. Nell'esperimento 2 sono state valutate l'influenza della donatrice sul numero di follicoli, il numero di oociti recuperati e la produzione di blastocisti. È stato dimostrato che esiste una elevata variabilità individuale in questa specie e che è possibile selezionare le migliori donatrici effettuando uno screening preliminare, mediante ecografia, della popolazione follicolare prima dell'inizio dell’aspirazione. I dati registrati durante la prima sessione possono essere utili indicatori dei potenziali germinali delle donatrici a medio-lungo termine. In altre parole è possibile effettuare uno screening preliminare affidabile, mediante un semplice esame ecografico eseguito al tempo 0, delle migliori donatrici di oociti vitali. Pertanto, i risultati di questo lavoro hanno dimostrato una influenza materna sul reclutamento follicolare, così come sulla produzione di oociti e blastocisti in vitro nel bufalo. Ciò significa che ci sono donatrici buone e non buone. Inoltre, l’importanza di questo screening risiede nella possibilità di selezionare in maniera attendibile le migliori donatrici, abbattendo i costi di laboratorio, e rendendo l’Opu una tecnica fruibile su larga scala. Nell'esperimento 3 è stato dimostrato che il Cryotop (CTV) è un metodo affidabile per la crioconservazione di embrioni bufalini prodotti in vitro, come indicato dall’elevato tasso di sopravvivenza post-scongelamento e il conseguente attecchimento in vivo. Inoltre, sulla base dei risultati è emerso che gli embrioni che si sviluppano più precocemente, sono meno sensibili alle lesioni da crioconservazione. Infatti, i più alti tassi di sopravvivenza sono stati registrati allo stadio di blastocisti sgusciate (HBL) e i più bassi allo stadio di morula compatta (TM). Nell’Esperimento 3b, è stata valutata la sopravvivenza in vivo di embrioni prodotti in vitro dopo ET derivati da OPU . Una netta differenza nel tasso di gravidanza a 25 giorni è emersa tra gli embrioni veloci e lenti. Gli alti tassi di gravidanza registrati tra 25 e 45 giorni indicano che il metodo CTV è adatto per la crioconservazione di embrioni di bufalo. I risultati di questo studio suggeriscono di selezionare per la crioconservazione e il successivo trasferimento gli embrioni di bufalo prodotti in vitro con una migliore cronologia di sviluppo. Tuttavia, una severa selezione degli embrioni, pur migliorando l'efficienza di crioconservazione, limiterà il numero totale di embrioni prodotti rendendo il rapporto costi-benefici dell’IVEP più sfavorevole. Questi risultati suggeriscono di indagare con metodi enzimatici e trascrizionali le differenze tra embrioni a diversa velocità di sviluppo, al fine di ipotizzare strategie correttive per migliorare la qualità dell'embrione. I risultati dell'esperimento 4 hanno dimostrato che l'espressione dei trascritti per alcuni geni chiave coinvolti nello sviluppo dell'embrione, come GLUT1 e Cx43, nonché la capacità antiossidante, degli embrioni prodotti in vitro, misurata dalla determinazione dei livelli di MnSOD, sono diverse in relazione alla qualità embrionale, sulla base della cronologia di sviluppo. Nel presente studio è emerso che la maggiore vitalità degli embrioni più veloci corrisponde a una modifica nel meccanismo antiossidante, nonché in quello del trasporto di glucosio/metabolismo e formazione di GAP-junctions. Inoltre anche l’aumento dell’attività MnSOD negli embrioni più rapidi e quindi più vitali, indica un minor stress ossidativo. Infatti le HBL, che sono lo stadio più avanzato che un embrione possa raggiungere in vitro, alle quali sono associate anche le più alte percentuali di gravidanza, sono risultati gli embrioni che hanno registrato i valori più elevati di MnSOD. Nell'esperimento 4 abbiamo scelto di analizzare un set di trascritti genici associati allo sviluppo embrionale pre-impianto. I risultati di questo esperimento dimostrano che gli embrioni più veloci hanno una maggiore espressione per il gene coinvolto nel trasporto e metabolismo del glucosio, come GLUT1, ma una ridotta espressione dei trascritti per Cx43, noto per svolgere un ruolo nella formazione di giunzione GAP, rispetto ai embrioni che si sviluppano più lentamente. Le alterazioni osservate nei bio-markers dello stress ossidativo e l'espressione di mRNA GLUT1, sembrano direttamente correlati alla qualità delle blastocisti. La sfida per il futuro è di modificare le condizioni di coltura in vitro al fine di produrre embrioni di qualità superiore che siano quanto più possibile simili a quelli prodotti in vivo. In conclusione i nostri risultati suggeriscono che il miglioramento della tecnologia OPU-IVEP nella specie bufalina è possibile. Infatti, al fine di migliorare l’efficienza, si consiglia di effettuare la raccolta degli oociti e il trasferimento degli embrioni nel corso di mesi autunnali. Inoltre, per ottimizzare il rapporto costi-benefici, è possibile selezionare le migliori donatrici in base alla popolazione follicolare prima di coinvolgerle nei programmi di IVEP. È stato inoltre dimostrato che è estremamente importante selezionare, per la crioconservazione e il successivo trasferimento, solo gli embrioni prodotti in vitro di qualità superiore in base alla loro cronologia di sviluppo. In fine, i risultati di questo studio suggeriscono che l'ottimizzazione del sistema IVEP è possibile anche migliorando la fase di coltura, tramite l'integrazione di agenti antiossidanti per identificare la fonte di energia più appropriata, ed/o per creare un microambiente che permetta agli embrioni di aumentare il consumo di glucosio, migliorandone la competenza. Tuttavia, ulteriori studi sono necessari per analizzare l’espressione di altri geni critici coinvolti nello sviluppo pre-impianto.