Studi molecolari dello stato della cromatina dopo induzione della Spreading Depression in cellule nervose

Lo studio è stato focalizzato sulle possibili modifiche epigenetiche, legate al fenomeno di Preconditioning, dopo induzione della Cortical Spreading Depression (CSD). Per effettuare tali studi sono stati utilizzati due sistemi: il primo in vivo, costituito da ratti trattati per la CSD e il secondo in vitro, dove è stata utilizzata una linea cellulare tumorale umana indotta a differenziare e trattata per il Preconditioning. In cervelli di ratto trattati per CSD si sono misurati i livelli di espressione delle DNA metiltrasferasi Dnmt3a, Dnmt3b, Dnmt1, che sono risultati aumentati a tempi diversi dopo il trattamento. Inoltre attraverso esperimenti di meDIP si è dimostrato che in cervelli di ratto trattati per CSD il livello di metilazione del DNA relativo a sequenze ripetute LINE1 era aumentato dopo induzione, suggerendo che il preconditioning possa prevenire la mobilizzazione delle sequenze ripetute così da ottenere un aumento della stabilità genomica correlato al meccanismo di neuroprotezione. Infatti dall’analisi delle quantità di trascritti si è registrata anche una diminuzione del livello di espressione sia delle sequenze ripetute LINE 1 che L1. Si è inoltre messo a punto un sistema modello in vitro per lo studio del Preconditioning. A tale scopo è stata utilizzata una linea cellulare umana di neuroblastoma, SHSY5Y, indotta a differenziare tramite l’utilizzo di acido retinoico, e in seguito trattata per l’induzione del Preconditioning con KCl. Le cellule sono state poi sottoposte a danno attraverso trattamento con perossido di idrogeno e si è analizzato, attraverso un saggio di vitalità cellulare (MTT test), la percentuale di cellule sopravvissute rispetto a quelle controllo non precondizionate ma danneggiate. Tali cellule mostrano una percentuale di sopravvivenza di circa il 40% in più. Si è studiato quindi mediante qPCR il profilo di espressione di alcuni geni neuroprotettivi a diversi tempi sia dopo induzione con KCl sia dopo preconditioning e danno. I geni analizzati sono stati: per il fattore trascrizionale CREB, per HIF1 Hypoxia inducible factor 1- per BDNF Brain derived neurotrophic factor), per BDNF-AS l’antisenso del gene Brain derived neurotrophic factor, per c-Fos. Per i quattro geni CREB, HIF1alfa, BDNF, BDNF-AS è stato dimostrato un aumento del livello di espressione, a tempi diversi dipendenti dal gene in esame, già con il solo trattamento con KCl e anche dopo induzione del danno molecolare. Questi dati fanno ipotizzare il coinvolgimento dell’attività di questi geni nel fenomeno del Preconditioning . In conclusione i risultati ottenuti dimostrano il coinvolgimento anche di modifiche epigenetiche a carico della metilazione del DNA nel fenomeno di Preconditioning connesso alla CSD in emisferi cerebrali di ratto. Inoltre è stato messo a punto un sistema in vitro da utilizzare per successivi studi del fenomeno biologico del Preconditioning.