Effetti della berberina e del riso rosso fermentato sulla modulazione redox nelle ellule di adenocarcinoma del colon umano (CaCo2)

Introduzione e Scopo: Le specie reattive dell???ossigeno (ROS) svolgono un importante ruolo di regolazione nei processi di trasduzione del segnale modulando numerosi processi fisiologici. Tra i principali sistemi enzimatici produttori di ROS vi sono le Dual Ossidasi (DUOX) 1 e 2 dotati di una duplice attività NADPH ossidasica e perossidasica Ca++-dipendente, espressi ad elevati livelli nella tiroide, nell???epitelio delle vie respiratorie, nel sistema immunitario ed in vari tratti del sistema digerente. In questa sede, DUOX è implicato nei meccanismi di difesa anti batterica; tuttavia non sono noti i suoi meccanismi di regolazione ed il suo coinvolgimento nei meccanismi trasduzionali mediati dai ROS indotti dai fattori di crescita in grado di mantenere l???integrità della barriera mucosale. I nostri studi sono stati condotti su cellule di adenocarcinoma del colon umano (Caco-2) dove è stata valutata la modulazione sia dei livelli di proteina che di mRNA di DUOX-2 mediata dall???attivazione del pathway trasduzionale del fattore di crescita epidermico (EGF). Inoltre, in queste stesse cellule, abbiamo valutato gli effetti della Berberina (BRB) e del riso rosso fermentato (Monacolina K), sostanze capaci di modulare i livelli di ROS, sull???espressione di DUOX 2. Materiali e metodi: Le Caco-2 sono state cresciute,fino al raggiungimento del differenziamento(7-10 gg) in mezzo DMEM completo. La stimolazione con EGF 200 nM è stata effettuata su cellule preincubate in 0,2% FBS per 18h. L???espressione proteica ed i livelli di mRNA sono stati valutati, rispettivamente, mediante analisi di Western Blot di real time PCR. L???attività di DUOX-2 è stata determinata mediante la misura fluorimetrica dei livelli di ROS sono utilizzando la diclorofluoresceina di acetato (DCFH-DA) in presenza ed in assenza di un chelante del Ca++ intracellulare il BAPTA-AM e dopo stimolazione con dosi crescenti (10, 50 ug/ml) di BRB e di riso rosso fermentato 1.5% S.C.(Specific Conentration monacolina K) (Rottapharm/Madaus). Le due sostanze sono state utilizzate singolarmente od in associazione per un tempo da 5 a 120 minuti. Risultati: I livelli della proteina e del mRNA di DUOX-2 in cellule Caco-2 risultano significativamente (p< 0,001) aumentati nelle cellule cresciute in presenza del 10% di FBS o stimolate con EGF, rispetto al controllo preincubato per 18h in 0,2% FBS confermando un ruolo rilevante dei fattori di crescita nella modulazione dei livelli proteici di DUOX2. La stimolazione con EGF determina anche un aumento dell???attività enzimatica di DUOX2, inoltre, incubazioni con basse dosi di perossido di idrogeno mimano gli effetti dei fattori di crescita inducendo l???espressione di DUOX2. La stimolazione con EGF, inoltre, attiva il circuito redox PKC/ERK/NADPH ossidasi/ROS, importante ai fini della trasduzione del segnale cellulare, come dimostrato dalla reversione dell???effetto stimolante dell???EGF su DUOX2 da parte di inibitori della PKC (BDM), di MAPK (PD98059) e dalla NADPH ossidasi (apocinina). L???incubazione delle Caco-2 con BRB e riso rosso fermentato porta ad un aumento significativo (p< 0,001) sia dei livelli di ROS Ca++-dipendente che dei livelli proteici di DUOX2, dimostrando che il loro effetto pro-ossidante modula l???attività di DUOX2. Conclusioni: I nostri dati individuano l???esistenza di un nuovo meccanismo di regolazione dell???enzima DUOX mediante l???attivazione dell???EGFr con rilascio di calcio intracellulare e relativo aumento dei livelli di ROS. In letteratura è noto che nel tratto intestinale, l???attivazione del pathway dell???EGFr porta ad un aumento dei livelli di mucina 5AC con conseguente protezione della mucosa intestinale. Nel nostro modello cellulare, abbiamo dimostrato che la BRB e il riso rosso fermentato portano ad incrementi dei livelli di ROS, quindi, attraverso l???aumento dei ROS, potrebbero potenziare il circuito trasduzionale attivato dall???EGFr esercitando effetti protettivi sulla mucosa intestinale.