Cromatografia Liquida-Spettrometria di Massa. Un Nuovo Approccio alla Determinazione di Yessotossine Nuove e Non da Mitili e Dinoflagellati Raccolti nel Mar Adriatico

Dal 1995 la yessotossina (YTX) e i suoi analoghi sono le principali biotossine implicate nella contaminazione dei mitili del mar Adriatico.Sebbene in passato la YTX sia stata associata alla sindrome di avvelenamento diarroico da molluschi (DSP, Diarrhetic Shellfish Poisoning), in quanto spesso presente nel materiale contaminato insieme all???acido okadaico e ai suoi analoghi, essa differisce significativamente dalle altre DSP tossine nell???essere non-diarreogenica, nè indurre inibizione della protein fosfatasi 2A. Studi tossicologici necessari a valutare i rischi per la salute umana della YTX sono stati finora impediti dalla quantità estremamente limitata di tossina disponibile. Il metodo più comunemente usato per la rivelazione della yessotossina e dei suoi analoghi nei laboratori di controllo è il saggio di tossicità sul topo per le DSP tossine. Tale saggio è sicuramente rapido, molto sensibile e poco costoso, tuttavia, non fornisce informazioni quantitative, è soggetto a falsi positivi, e, soprattutto, non è in grado di definire la natura delle singole sostanze responsabili della tossicità. Inoltre, la presenza di yessotossina nei mitili può portare a sovrastima del rischio da DSP tossine nei consumatori quando tale saggio è utilizzato. Infatti, la letalità per iniezione intraperitoneale della YTX (0.1 mg/kg) è la più alta tra le DSP tossine, mentre gli effetti tossici della yessotossina sull???uomo non sono stati ancora provati. Metodi strumentali che permettano una rivelazione sensibile, quantitativa, precisa e automatizzabile delle yessotossine sono dunque necessari sia per i laboratori di monitoraggio che per quelli di ricerca. Il metodo analitico più comunemente usato per la rivelazione della YTX prevede la sua derivatizzazione con un appropriato reagente dienofilo a formare un derivato fluorescente seguita da analisi HPLC. Sfortunatamente, il metodo non permette una rivelazione di tutti i derivati della YTX, in quanto non è applicabile alla rivelazione di quei derivati che mancano di un diene coniugato in catena laterale. Una valida alternativa è costituita dall???accoppiamento cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS), una tecnica universale, selettiva ed altamente sensibile che permette di rivelare tossine intatte, non derivatizzate e loro derivati in estratti relativamente grezzi. Non esiste a tutt???oggi un metodo LC-MS che permetta la rivelazione contemporanea di tutte le yessotossine. Sulla base di queste considerazioni il nostro gruppo ha esteso l???applicabilità del metodo LC-MS sviluppato da Quilliam et al. per la rivelazione delle tossine lipofile, alla separazione e rivelazione univoca di tutte le yessotossine finora isolate anche in presenza di acido okadaico. Il metodo messo a punto permette di determinare e confermare direttamente nell???estratto grezzo tutte le tossine di interesse in un'unica corsa cromatografica di 25 minuti e presenta un limite di rivelazione di 70 pg per la yessotossina. L???applicazione del metodo all???analisi di campioni di Mytilus galloprovincialis, ha permesso di mettere in luce la presenza nell???estratto grezzo, insieme a derivati noti della YTX, di un nuovo analogo della yessotossina, la 42,43,44,45,46,47,55-eptanor-41-oxoYTX la cui struttura è stata proposta sulla base di evidenze cromatografiche ed esperimenti MS/MS. L???analisi LC-MS di un campione di Protoceratium reticulatum ha permesso, infine, di individuare in tale dinoflagellato l???organismo produttore della yessotossina e di numerosi suoi analoghi (2, 3, 5, 7).Tale risultato apre nuove prospettive alla preparazione di standard degli analoghi della yessotossina necessari per studi farmacologici.