Nell’ambito del progetto presentato l'unità del prof. Pucci (UO4) si occuperà essenzialmente di 2 aspetti della via di trasduzione del segnale trasmesso dalla via PI3K/PTEN/AKT: 1. Analisi biochimica dell’interazione fra AKT e p27 Si effettueranno saggi di fosforilazione in vitro usando AKT come chinasi e p27 «wild-type» e/o mutante come substrati, per determinare se AKT è in grado di fosforilare p27 e, contemporaneamente, per identificare i siti di fosforilazione sia in vitro che in vivo. La presenza di siti eventuali di fosforilazione verra' determinata sia mediante tecniche biochimiche tradizionali (UO1) che mediante analisi strutturali effettuate con tecniche avanzate di spettrometria di massa (UO4). Successivamente, si determineranno gli effetti della fosforilazione della treonina 157 sulle proprietà biochimiche e biologiche della proteina p27, sia in vitro che in vivo. 2. Identificazione di molecole regolative della via PI3K/PTEN/AKT mediante screening di interattori di PTEN. Si propone di identificare eventuali proteine in grado di interagire in vivo con PTEN formando stabili complessi non covalenti, che potenzialmente ne regolano così l’attività. Gli interattori di PTEN verranno identificati mediante la strategia del «fishing for partners». Il dominio C-terminale di PTEN opportunamente modificato con un tag di 6 His verrà utilizzato come esca per identificare substrati proteici in grado di formare in vivo stabili interazioni non-covalenti. Il tag di 6-His consentirà di purificare il complesso PTEN-ligando in modo selettivo mediante opportune colonne contenenti ioni nichel. L’eluato proteico verrà poi sottoposto a separazione su gel di poliacrilammide. Le bande proteiche rilevate verranno sottoposte ad idrolisi enzimatica e/o chimica in situ. Le miscele peptidiche cosi’ ottenute verranno in seguito analizzate mediante spettrometria di massa MALDI e immessi in alcuni «mass search programs» come ProFound o Peptide Search. Condizione necessaria al riconoscimento è la presenza della proteina ricercata nel database.
Dissezione della via di trasduzione del segnale mediato dalla via PI3K/PTEN/AKT nel carcinoma della mammella / Pucci, Pietro. - (2001). (Intervento presentato al convegno 2. Identificazione di molecole regolative della via PI3K/PTEN/AKT mediante screening di interattori di PTEN. nel 4/09/2002).
Dissezione della via di trasduzione del segnale mediato dalla via PI3K/PTEN/AKT nel carcinoma della mammella
PUCCI, PIETRO
2001
Abstract
Nell’ambito del progetto presentato l'unità del prof. Pucci (UO4) si occuperà essenzialmente di 2 aspetti della via di trasduzione del segnale trasmesso dalla via PI3K/PTEN/AKT: 1. Analisi biochimica dell’interazione fra AKT e p27 Si effettueranno saggi di fosforilazione in vitro usando AKT come chinasi e p27 «wild-type» e/o mutante come substrati, per determinare se AKT è in grado di fosforilare p27 e, contemporaneamente, per identificare i siti di fosforilazione sia in vitro che in vivo. La presenza di siti eventuali di fosforilazione verra' determinata sia mediante tecniche biochimiche tradizionali (UO1) che mediante analisi strutturali effettuate con tecniche avanzate di spettrometria di massa (UO4). Successivamente, si determineranno gli effetti della fosforilazione della treonina 157 sulle proprietà biochimiche e biologiche della proteina p27, sia in vitro che in vivo. 2. Identificazione di molecole regolative della via PI3K/PTEN/AKT mediante screening di interattori di PTEN. Si propone di identificare eventuali proteine in grado di interagire in vivo con PTEN formando stabili complessi non covalenti, che potenzialmente ne regolano così l’attività. Gli interattori di PTEN verranno identificati mediante la strategia del «fishing for partners». Il dominio C-terminale di PTEN opportunamente modificato con un tag di 6 His verrà utilizzato come esca per identificare substrati proteici in grado di formare in vivo stabili interazioni non-covalenti. Il tag di 6-His consentirà di purificare il complesso PTEN-ligando in modo selettivo mediante opportune colonne contenenti ioni nichel. L’eluato proteico verrà poi sottoposto a separazione su gel di poliacrilammide. Le bande proteiche rilevate verranno sottoposte ad idrolisi enzimatica e/o chimica in situ. Le miscele peptidiche cosi’ ottenute verranno in seguito analizzate mediante spettrometria di massa MALDI e immessi in alcuni «mass search programs» come ProFound o Peptide Search. Condizione necessaria al riconoscimento è la presenza della proteina ricercata nel database.I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
