L'obiettivo ultimo dell'attività di ricerca di questa Unità sarà quello di fornire a tutti i gruppi partecipanti al progetto un ausilio strutturale basato sull'applicazione di metodologie avanzate di MS. Lo scopo principale è di integrare gli studi strutturali condotti dalle altre singole Unità con strategie, tecniche e "know-how" complementari sviluppate dalla nostra Unità negli ultimi dieci anni. Le attività di queste Unità saranno rivolte a due principali obiettivi: in primo luogo la caratterizzazione di modifiche post-traduzionali in proteine oggetto di studio in altri laboratori, con particolare attenzione alla glicosilazione. In secondo luogo si provvederà all'analisi della topologia di queste ptoteine e dei loro complessi con ligandi idrofobici. I risultati di questi studi completeranno le analisi cristallografiche e di NMR e saranno usati per verificare e rifinire modelli proteici ottenuti da tecniche di simulazione. A questo proposito è da sottolineare che attualmente sono in corso una serie di strette collaborazioni tra questa Unità ed i gruppi dei Proffs. H. Monaco e M. Galliano. Sulla base di queste considerazioni, è chiaro che ulteriori relazioni scientifiche potranno essere stabilite con tutte le Unità di ricerca partecipanti al progetto. Lo scopo di questa integrazione è di stabilire un circolo interattivo con informazioni che fluiscono dal "molecular modelling" alle analisi sperimentali, allo studio di struttura tridimensionale, dando origine ad un effetto sinergico rivolto alla definizione degli aspetti strutturali di proteine che legano molecole idrofobiche. Le attività di ricerca specifiche svolte dall'Unità di Napoli possono essere suddivise in due linee: 1. Caratterizzazione di modifiche post-traduzionali L'alfa-1-microglobulina (HC) e la Riboflavin Binding Protein (RfBP) contengono varie modifiche post-traduzionali. In particolare, HC consiste di una singola catena polipeptidica di 183 amminoacidi contenente sia oligosaccaridi N- ed O-linked la cui struttura non è stata ancora determinata, che un gruppo cromoforo fluorescente di natura sconosciuta responsabile della colorazione brunastra della proteina. RfBP è una glicoproteina presente nelle uova e nel siero di uccelli ed altri animali. La proteina purificata da diversi tessuti mostra la stessa sequenza amminoacidica, ma diverse strutture glicidiche. L'HC urinaria e la RfBP saranno purificate dalle Unità dei Proffs. Speziale e Monaco rispettivamente, e la componente glicidica di queste proteine sarà caratterizzata da questa Unità utilizzando una strategia a più stadi. In primo luogo, la composizione in monosaccaridi sarà determinata mediante idrolisi delle glicoproteine in condizioni tali da consentire il rilascio dei singoli zuccheri seguita da opportune derivatizzazioni della singola miscela di monosaccaridi che verrà infine analizzata mediante CGMS. Le componenti glicidiche intatte saranno rilasciate dalle glicoproteine mediante riduzione e carbossimetilazione delle proteine in condizioni denaturanti, seguite da idrolisi con opportuni enzimi. La miscela peptidica risultante sarà incubata con PNGase F o idrolizzata con metodi chimici; gli oligosaccaridi saranno separati dalla componente peptidica, derivatizzati mediante permetilazione e/o acetilazione e direttamente analizzati mediante MALDIMS. Questa analisi condurrà alla definizione delle diverse strutture glicidiche presenti nelle glicoproteine, incluso il pattern di ramificazione la definizione della sequenza delle antenne e l'identificazione di eventuali gruppi modificanti come solfati, fosfati, gruppi acetili etc. La stessa strategia sarà applicata alla definizione delle strutture oligosaccaridiche presenti sulle HC e RfBP purificate da fluido amniotico, nel momento in cui esse saranno rese disponibili dall' Unità del Prof. Speziale. Questa analisi consentirà di paragonare la componente glicidica delle stesse proteine ottenute da diversi tessuti. La struttura e il sito di legame del cromoforo incognito legato all'HC urinaria sarà studiata attraverso idrolisi della proteina utilizzando CNBr e tripsina ed analisi delle miscele peptidiche generate mediante MS. Il peso molecolare dei singoli peptidi sarà confrontato con quello previsto sulla base della sequenza amminoacidica della proteina ed i frammenti peptidici legati al cromoforo identificati dal loro valore di massa anomalo. Il sito della modifica e la natura del cromoforo fluorescente saranno determinati utilizzando varie metodologie di MS, tra cui anche tecniche di MS/MS. 2. Topologia di proteine e complessi proteici. L'albumina umana del siero (HSA) è costituita da tre domini stabili, definiti A, B, e C, separati in seguito ad idrolisi con CNBr della proteina senza riduzione dei ponti disolfuro. Il Frammento C è stato identificato come sito di legame dell'albumina per una serie di ligandi idrofobici quali la bilirubina, l'ematina e la riboflavina; finora non esistono dati strutturali circa il Frammento C o i suoi complessi. Questo frammento sarà prodotto e purificato dall'Unità del Prof. Speziale e caratterizzato attraverso procedure di MS. Analisi conformazionali del Frammento C saranno condotte mediante esperimenti di proteolisi limitata utilizzando proteasi a diverse specificità in condizioni strettamente controllate. I frammenti ottenuti, saranno separati mediante HPLC e analizzati utilizzando la spettrometria di massa electrospray (ESMS). I peptidi identificati mediante il peso molecolare accurato condurranno alla definizione dei siti di idrolisi e quindi dei residui maggiormente esposti. La stessa procedura integrata sarà applicata all'analisi dei complessi del Frammento C con ligandi idrofobici. In seguito alla formazione del complesso, il pattern proteolitico della proteina risulterà alterato sia causa dell'effetto di protezione svolto dal ligando che a causa di possibili variazioni conformazionali avvenute durante l'interazione proteina-ligando. I siti di idrolisi preferenziali osservati nel complesso saranno quindi paragonati con quelli identificati sul frammento isolato. Alternativamente, la topologia del Frammento C e dei suoi complessi sarà studiata attraverso modificazioni chimiche selettive di specifici residui utilizzando diversi reagenti. Le condizioni sperimentali saranno scelte in modo da limitare la modifica ad un numero ben definito di amminoacidi. Le proteine modificate saranno isolate mediante HPLC ed il numero di amminoacidi modificati identificato attraverso la determinazione del peso molecolare accurato della specie modificata mediante ESMS. Quindi gli amminoacidi modificati saranno identificati mediante idrolisi della proteina seguita da analisi MALDIMS delle miscele peptidiche risultanti. Il pattern di amminoacidi modificati individuati nel complesso sarà paragonato con quello determinato sulla proteina isolata. I dati ottenuti mediante le due procedure consentiranno di definire quelle regioni funzionali del Frammento C esposte al solvente che diventano poi nascoste in seguito al legame con i ligandi e quelle coinvolte in variazioni conformazionali avvenute in seguito alla formazione del complesso. Questi dati saranno usati per integrare le analisi ai raggi X condotte sui complessi del Frammento C svolte dall'Unità del Prof. Monaco. La struttura tridimensionale della beta Lattoglobulina bovina (LG) a pH fisiologico è stata risolta mediante analisi diffrattometriche; studi di NMR sulla conformazione della proteina a pH acido sono attualmente in corso presso l'Unità della Prof. Molinari. E' stato proposto che la LG leghi acidi grassi ed altri ligandi idrofobici a due siti diversi, ma al momento non sono disponibili dati strutturali su questi complessi. Questa Unità si propone di studiare i complessi della LG con vari ligandi idrofobici quali acido palmitico, retinolo ed ANS utilizzando esperimenti di proteolisi limitata accoppiati ad analisi di MS. I siti proteolitici preferenziali sui diversi complessi saranno individuati applicando la strategia descritta in precedenza. Le distribuzioni dei siti di "cleavage" ottenute per i vari complessi saranno paragonate allo scopo di individuare il sito di binding di ciascun ligando. Questi risultati complementeranno i dati ottenuti dalle analisi NMR condotte a pH acido dall'Unità della Prof. Molinari e dagli studi di diffrazione dei raggi X effettuati dall'Unità del Prof. Monaco.

Studi strutturali su proteine che legano molecole idrofobiche / Pucci, Pietro. - (1998). (Intervento presentato al convegno TOPOLOGIA DI COMPLESSI PROTEINA-LIGANDI IDROFOBICI MEDIANTE SPETTROMETRIA DI MASSA nel 20/12/1998).

Studi strutturali su proteine che legano molecole idrofobiche

PUCCI, PIETRO
1998

Abstract

L'obiettivo ultimo dell'attività di ricerca di questa Unità sarà quello di fornire a tutti i gruppi partecipanti al progetto un ausilio strutturale basato sull'applicazione di metodologie avanzate di MS. Lo scopo principale è di integrare gli studi strutturali condotti dalle altre singole Unità con strategie, tecniche e "know-how" complementari sviluppate dalla nostra Unità negli ultimi dieci anni. Le attività di queste Unità saranno rivolte a due principali obiettivi: in primo luogo la caratterizzazione di modifiche post-traduzionali in proteine oggetto di studio in altri laboratori, con particolare attenzione alla glicosilazione. In secondo luogo si provvederà all'analisi della topologia di queste ptoteine e dei loro complessi con ligandi idrofobici. I risultati di questi studi completeranno le analisi cristallografiche e di NMR e saranno usati per verificare e rifinire modelli proteici ottenuti da tecniche di simulazione. A questo proposito è da sottolineare che attualmente sono in corso una serie di strette collaborazioni tra questa Unità ed i gruppi dei Proffs. H. Monaco e M. Galliano. Sulla base di queste considerazioni, è chiaro che ulteriori relazioni scientifiche potranno essere stabilite con tutte le Unità di ricerca partecipanti al progetto. Lo scopo di questa integrazione è di stabilire un circolo interattivo con informazioni che fluiscono dal "molecular modelling" alle analisi sperimentali, allo studio di struttura tridimensionale, dando origine ad un effetto sinergico rivolto alla definizione degli aspetti strutturali di proteine che legano molecole idrofobiche. Le attività di ricerca specifiche svolte dall'Unità di Napoli possono essere suddivise in due linee: 1. Caratterizzazione di modifiche post-traduzionali L'alfa-1-microglobulina (HC) e la Riboflavin Binding Protein (RfBP) contengono varie modifiche post-traduzionali. In particolare, HC consiste di una singola catena polipeptidica di 183 amminoacidi contenente sia oligosaccaridi N- ed O-linked la cui struttura non è stata ancora determinata, che un gruppo cromoforo fluorescente di natura sconosciuta responsabile della colorazione brunastra della proteina. RfBP è una glicoproteina presente nelle uova e nel siero di uccelli ed altri animali. La proteina purificata da diversi tessuti mostra la stessa sequenza amminoacidica, ma diverse strutture glicidiche. L'HC urinaria e la RfBP saranno purificate dalle Unità dei Proffs. Speziale e Monaco rispettivamente, e la componente glicidica di queste proteine sarà caratterizzata da questa Unità utilizzando una strategia a più stadi. In primo luogo, la composizione in monosaccaridi sarà determinata mediante idrolisi delle glicoproteine in condizioni tali da consentire il rilascio dei singoli zuccheri seguita da opportune derivatizzazioni della singola miscela di monosaccaridi che verrà infine analizzata mediante CGMS. Le componenti glicidiche intatte saranno rilasciate dalle glicoproteine mediante riduzione e carbossimetilazione delle proteine in condizioni denaturanti, seguite da idrolisi con opportuni enzimi. La miscela peptidica risultante sarà incubata con PNGase F o idrolizzata con metodi chimici; gli oligosaccaridi saranno separati dalla componente peptidica, derivatizzati mediante permetilazione e/o acetilazione e direttamente analizzati mediante MALDIMS. Questa analisi condurrà alla definizione delle diverse strutture glicidiche presenti nelle glicoproteine, incluso il pattern di ramificazione la definizione della sequenza delle antenne e l'identificazione di eventuali gruppi modificanti come solfati, fosfati, gruppi acetili etc. La stessa strategia sarà applicata alla definizione delle strutture oligosaccaridiche presenti sulle HC e RfBP purificate da fluido amniotico, nel momento in cui esse saranno rese disponibili dall' Unità del Prof. Speziale. Questa analisi consentirà di paragonare la componente glicidica delle stesse proteine ottenute da diversi tessuti. La struttura e il sito di legame del cromoforo incognito legato all'HC urinaria sarà studiata attraverso idrolisi della proteina utilizzando CNBr e tripsina ed analisi delle miscele peptidiche generate mediante MS. Il peso molecolare dei singoli peptidi sarà confrontato con quello previsto sulla base della sequenza amminoacidica della proteina ed i frammenti peptidici legati al cromoforo identificati dal loro valore di massa anomalo. Il sito della modifica e la natura del cromoforo fluorescente saranno determinati utilizzando varie metodologie di MS, tra cui anche tecniche di MS/MS. 2. Topologia di proteine e complessi proteici. L'albumina umana del siero (HSA) è costituita da tre domini stabili, definiti A, B, e C, separati in seguito ad idrolisi con CNBr della proteina senza riduzione dei ponti disolfuro. Il Frammento C è stato identificato come sito di legame dell'albumina per una serie di ligandi idrofobici quali la bilirubina, l'ematina e la riboflavina; finora non esistono dati strutturali circa il Frammento C o i suoi complessi. Questo frammento sarà prodotto e purificato dall'Unità del Prof. Speziale e caratterizzato attraverso procedure di MS. Analisi conformazionali del Frammento C saranno condotte mediante esperimenti di proteolisi limitata utilizzando proteasi a diverse specificità in condizioni strettamente controllate. I frammenti ottenuti, saranno separati mediante HPLC e analizzati utilizzando la spettrometria di massa electrospray (ESMS). I peptidi identificati mediante il peso molecolare accurato condurranno alla definizione dei siti di idrolisi e quindi dei residui maggiormente esposti. La stessa procedura integrata sarà applicata all'analisi dei complessi del Frammento C con ligandi idrofobici. In seguito alla formazione del complesso, il pattern proteolitico della proteina risulterà alterato sia causa dell'effetto di protezione svolto dal ligando che a causa di possibili variazioni conformazionali avvenute durante l'interazione proteina-ligando. I siti di idrolisi preferenziali osservati nel complesso saranno quindi paragonati con quelli identificati sul frammento isolato. Alternativamente, la topologia del Frammento C e dei suoi complessi sarà studiata attraverso modificazioni chimiche selettive di specifici residui utilizzando diversi reagenti. Le condizioni sperimentali saranno scelte in modo da limitare la modifica ad un numero ben definito di amminoacidi. Le proteine modificate saranno isolate mediante HPLC ed il numero di amminoacidi modificati identificato attraverso la determinazione del peso molecolare accurato della specie modificata mediante ESMS. Quindi gli amminoacidi modificati saranno identificati mediante idrolisi della proteina seguita da analisi MALDIMS delle miscele peptidiche risultanti. Il pattern di amminoacidi modificati individuati nel complesso sarà paragonato con quello determinato sulla proteina isolata. I dati ottenuti mediante le due procedure consentiranno di definire quelle regioni funzionali del Frammento C esposte al solvente che diventano poi nascoste in seguito al legame con i ligandi e quelle coinvolte in variazioni conformazionali avvenute in seguito alla formazione del complesso. Questi dati saranno usati per integrare le analisi ai raggi X condotte sui complessi del Frammento C svolte dall'Unità del Prof. Monaco. La struttura tridimensionale della beta Lattoglobulina bovina (LG) a pH fisiologico è stata risolta mediante analisi diffrattometriche; studi di NMR sulla conformazione della proteina a pH acido sono attualmente in corso presso l'Unità della Prof. Molinari. E' stato proposto che la LG leghi acidi grassi ed altri ligandi idrofobici a due siti diversi, ma al momento non sono disponibili dati strutturali su questi complessi. Questa Unità si propone di studiare i complessi della LG con vari ligandi idrofobici quali acido palmitico, retinolo ed ANS utilizzando esperimenti di proteolisi limitata accoppiati ad analisi di MS. I siti proteolitici preferenziali sui diversi complessi saranno individuati applicando la strategia descritta in precedenza. Le distribuzioni dei siti di "cleavage" ottenute per i vari complessi saranno paragonate allo scopo di individuare il sito di binding di ciascun ligando. Questi risultati complementeranno i dati ottenuti dalle analisi NMR condotte a pH acido dall'Unità della Prof. Molinari e dagli studi di diffrazione dei raggi X effettuati dall'Unità del Prof. Monaco.
1998
Studi strutturali su proteine che legano molecole idrofobiche / Pucci, Pietro. - (1998). (Intervento presentato al convegno TOPOLOGIA DI COMPLESSI PROTEINA-LIGANDI IDROFOBICI MEDIANTE SPETTROMETRIA DI MASSA nel 20/12/1998).
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11588/459636
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