Meccanismi molecolari e controllo dello stato redox in seguito all'infezione da Helicobacter pylori

Il microrganismo Helicobacter pylori, responsabile di varie patologie quali gastriti e ulcere, colonizza la mucosa gastrica grazie all’adattamento alla crescita nell’ambiente acido dello stomaco. L’infezione può rimanere a lungo asintomatica e, se non riconosciuta ed eradicata con opportune terapie antibiotiche, può essere responsabile dello sviluppo di adenocarcinomi e linfomi gastrici. Nei tessuti colonizzati dal batterio si osserva una forte risposta infiammatoria con incremento della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), nonché riduzione dei livelli di ossido nitrico, un importante protettore della mucosa gastrica. Pur essendo un microaerofilo, H. pylori è ben adattato alla difesa contro i ROS, essendo dotato di efficienti sistemi enzimatici di difesa, come la superossido dismutasi (HpSOD). D’altra parte, al processo infiammatorio partecipa il peptide Hp(2-20), un fattore chemiotattico secreto da H. pylori, che manifesta le sue proprietà antibatteriche grazie all’induzione della produzione di ROS da parte della NADPH ossidasi dei neutrofili. Con questo progetto si studieranno alcuni aspetti molecolari e funzionali relativi all’infezione da H. pylori, approfondendo il significato di alcune specifiche proprietà strutturali e funzionali di HpSOD e caratterizzando alcuni meccanismi molecolari coinvolti nel controllo del potenziale redox in linee cellulari di adenocarcinoma gastrico, anche dopo stimolazione con Hp(2-20). E’ noto che HpSOD, l’enzima chiave per la detossificazione dall’anione superossido, possiede, diversamente da altre Fe- e Mn-SOD, un’estensione amminoacidica nella regione C-terminale, il cui ruolo è però ancora sconosciuto; inoltre, in alcune condizioni di crescita l’enzima si ancora al rivestimento flagellare del batterio; infine, l’attività di HpSOD probabilmente contribuisce alla riduzione dei livelli di NO nello stomaco. Un obiettivo della ricerca riguarderà lo studio del ruolo dell’estensione C-terminale dell’enzima nel meccanismo di patogenicità. In particolare, grazie alla disponibilità di una forma ricombinante di HpSOD, si identificheranno eventuali modifiche covalenti a carico di residui dell’estensione C-terminale della HpSOD, ma anche di altri regioni dell’enzima, che giocano un ruolo nella relazione struttura-funzione di HpSOD. Tra le modifiche covalenti da ricercare saranno particolarmente studiate la nitrazione, la S-glutationilazione e la fosforilazione, anche perché già riportate per altre SOD. Un altro aspetto riguarda la possibile reattività nei riguardi di agenti modificanti di un residuo di cisteina (C189) localizzato nella regione C-terminale della HpSOD. Infatti la presenza di HpSOD sulla superficie cellulare del batterio renderebbe possibile l’interazione dell’enzima con componenti cellulari secreti dalla mucosa infiammata, che potrebbero portare alla farnesilazione o acilazione della HpSOD. Questo tipo di modifica, che coinvolge residui di cisteina della regione C-terminale, consente l’ancoraggio di altre proteine alla membrana plasmatica. Per tutte le modifiche identificate, si procederà alla valutazione degli effetti biochimici (attività specifica, sensibilità ad inibitori ed inattivatori, termostabilità), nonché a stabilire il loro eventuale ruolo nell’ancoraggio dell’enzima al rivestimento flagellare del batterio. Infine, sarà avviato un progetto di mutagenesi che miri a definire il ruolo dei residui della regione C-terminale di HpSOD, producendo anche una forma troncata dell’enzima priva di tale estensione. E’ già noto che l’effetto stimolatorio di Hp(2-20) sulla NADPH ossidasi di neutrofili è mediato dal legame del peptide ai recettori per formil-peptidi (FRP). Si cercherà di caratterizzare i meccanismi molecolari responsabili della generazione di superossido da parte della NADPH ossidasi in due linee cellulari di adenocarcinoma gastrico, MKN-28 e AGS, nonché in biopsie di pazienti con infezione cronica da H. pylori. Saranno ricercati i partners molecolari della cascata di segnalazione responsabile dell’incremento del processo di proliferazione cellulare, identificando innanzitutto i membri della famiglia dei recettori per formil-peptidi e la componente catalitica (Nox) della NADPH ossidasi espressa in queste cellule. Tale identificazione fornirà importanti informazioni sulla cascata intracellulare coinvolta nella regolazione delle varie isoforme di Nox, in seguito all’interazione Hp(2-20)/FPR. Successivamente saranno studiati i meccanismi di attivazione di Nox, analizzando le chinasi responsabili della fosforilazione e della traslocazione della subunità regolatoria di questo enzima, nonché i pathways responsabili della proliferazione cellulare in queste linee tumorali. Infine si valuterà anche la capacità di Hp(2-20) di attivare i fattori trascrizionali STAT3 e HIF-1alfa, responsabili dell’ aumento della trascrizione, e quindi della sintesi del fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF), promuovendo così l’angiogenesi.