Energetica del riconoscimento del DNA e dell'attivazione trascrizionale del fattore di trascizione tiroideo di ratto (TTF-1)

La principale attività della presente unità è quella di determinare la termodinamica del riconoscimento del DNA e dell’attivazione trascrizionale del fattore di trascrizione tiroideo di ratto (TTF-1). L’Unità prevede di dare una descrizione più completa possibile della stabilità termodinamica della proteina (TTF-1), nonché dell’energetica della sua associazione con il DNA bersaglio e con altre proteine coinvolte nel processo di transattivazione come il fattore di trascrizione Pax-8 sia in forma libera che in complesso con il DNA. La determinazione dei parametri termodinamici dell’associazione tra DNA e proteine o tra proteine, specialmente se in combinazione con informazioni strutturali, è in grado di fornire una completa descrizione dei contributi energetici dell’interazione e aiutare nell’identificazione delle regioni dell’interfaccia di riconoscimento. Tutti i parametri termodinamici dell’associazione, la costante di equilibrio, la variazione dell’energia di Gibbs, dell’entalpia, dell’entropia e della capacità termica, nonchè la stechiometria dell’interazione, saranno determinati mediante misure di calorimetria di titolazione isoterma (ITC) e di fluorescenza. La stabilità conformazionale dell’omeodominio di TTF-1 e di mutanti di amminoacidi presenti nella regione di riconoscimento, saranno studiati mediante dicroismo circolare (CD) e microcalorimetria differenziale a scansione (DSC). Il costrutto contenente il dominio N-terminale + l’omeodominio di TTF-1 sarà studiato mediante CD e DSC per determinare la stabilità termodinamica della proteina in presenza e in assenza del suo DNA bersaglio. Saranno inoltre determinati i parametri termodinamici dell’interazione tra il costrutto contenente il dominio N-terminale + l’omeodominio di TTF-1 e il fattore di trascrizione Pax-8 mediante tecniche calorimetriche e spettroscopiche.