Scopo del presente progetto é stata la dettagliata caratterizzazione dei pathway molecolari implicati nell’attivazione della NADPH ossidasi espressa in fibroblasti umani dopo stimolazione con peptidi formilati (N-fMLP) e non, nonché l’analisi di geni differenzialmente espressi in seguito a tale trattamento. L’approccio sperimentale utilizzato in questi studi é consistito nella stimolazione di fibroblasti umani IMR90 deprivati di siero, che esprimono una macchina molecolare simile alla NADPH ossidasi, con concentrazioni e tempi diversi di N-fMLP che rappresenta un forte attivatore della NADPH ossidasi fagocitica. E’ stata valutata la capacità dei formil-peptidi di attivare l’ossidasi mediante saggi di attività enzimatica ed analisi, mediante western blot, della subunità regolatoria citosolica p47phox della NADPH ossidasi, I risultati ottenuti dimostano che in seguito a tale trattamento si osserva i) una rapida attivazione della NADPH ossidasi, inibibile dalla superossido dismutasi; ii) la fosforilazione e la traslocazione sulla membrana di p47phox, che rappresenta l' evento necessario richiesto per l’attivazione di questa macchina molecolare. Inoltre, la pre-incubazione con PD098059, un inibitore di MEK1, prima della stimolazione previene completamente i fenomeni osservati suggerendo il coinvolgimento delle ERK in questi eventi. Abbiamo infatti successivamente dimostrato che in fibroblasti umani IMR90 deprivati di siero, concentrazioni micromolari di N-fMLP inducono una rapida fosforilazione/attivazione di ERK1/2, misurata in esperimenti di western blot condotti con un anticorpo anti-fosfoERK e che questa è completamente prevenuta da PD098059. In cellule fagocitiche N-fMLP interagisce con almeno due tipi di recettore, uno ad alta affinità (FPR) e l’altro a bassa affinità (FPRL1), ed attiva una cascata di segnali, mediati da proteine G eterotrimeriche sensibili alla tossina della pertosse (PTX), che conduce alla migrazione cellulare, alla fagocitosi, al rilascio di mediatori pro-infiammatori ed alla generazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) via attivazione della NADPH ossidasi. Fibroblasti umani IMR90 deprivati di siero sono stati quindi preincubati con PTX prima della stimolazione con N-fMLP ed esperimenti condotti su estratti proteici purificati da queste cellule hanno dimostrato che PTX è in grado i) di inibire la fosforilazione delle ERK da parte del formil-peptide; ii) di prevenire l’attivazione NADPH-dipendente della NADPH ossidasi non fagocitica; iii) di inibire la fosforilazione e la traslocazione sulla membrana della subunità catalitica p47phox. Questi esperimenti suggeriscono che N-fMLP é capace di attivare la NADPH ossidasi via proteine G sensibili a PTX e che le cellule IMR90 esprimono recettori specifici per formil-peptidi. E’ stata quindi analizzata l’espressione in queste cellule del recettore FPR e FPRL1 mediante esperimenti di RT-PCR condotti su RNA totale purificato da cellule IMR90 ed utilizzando primer specifici. I risultati ottenuti hanno dimostrato che queste cellule esprimono soltanto il recettore a bassa affinità FPRL1 il quale é noto mostrare una più alta affinità per l’esapeptide WKYMVm (peptide W) rispetto a N-fMLP. Esperimenti condotti utilizzando il peptide W hanno infatti dimostrato la sua capacità di indurre una significativa attivazione delle ERK e la traslocazione sulla membrana di p47phox a concentrazioni più basse rispetto a quelle utilizzate per N-fMLP. Mediante saggi di legame al recettore, condotti con WKYMVm iodinato, é stato anche analizzato il legame specifico del peptide W su FPRL1. I risultati hannno dimostrato che sulla membrana dei fibroblasti umani sono espressi siti di legame per il peptide W i quali sono specificamente spiazzati da concentrazioni crescenti di peptide non marcato. Inoltre, l’analisi dei dati di binding hanno consentito di predirre una costante di dissociazione di 160 nM ed una densità di circa 16200 molecole di recettore/cellula. Tale recettore é biologicamente funzionale. Infatti, FPRL1, opportunamente clonato in un vettore di espressione eucariotica, é stato trasfettato in cellule HEK293 prima della stimolazione con N-fMLP (o con WKYMVm). Tali cellule esprimono NOX4, un membro della famiglia delle NADPH ossidasi non fagocitiche, ma non recettori per i formil-peptidi. La determinazione della produzione di anione superossido NADPH-dipendente, misurata come velocità di riduzione del citocromo c sensibile alla superossido dismutasi, ha dimostrato che in HEK293 trasfettate con FPRL1 è possibile misurare un significativo aumento di ROS, mentre nessun effetto è rivelabile nelle cellule trasfettate con il plasmide di controllo. Nelle cellule polimorfonucleate l’interazione tra i formil-peptidi ed i rispettivi recettori serpentinici accoppiati a proteine G eterotrimeriche attiva la fosfolipasi Cbeta che genera inositolo 1,4,5-trifosfato e diacil-glicerolo. La proteina kinasi C (PKC) così attivata é responsabile della fosforilazione di residui di serina (diversi da quelli che sono bersaglio delle ERK) della subunità regolatoria p47phox della NADPH ossidasi. E’ stato quindi valutato il ruolo delle PKC sull’attivazione della ossidasi non fagocitica in cellule IMR90, utilizzando inibitori specifici delle varie isoforme della famiglia di PKC (Go6983, Go6976, GF109203X e rottlerina). Go6976 inibisce preferenzialmente PKC alfa, beta e mu, Go6983 inibisce PKC alfa, beta, gamma, delta e teta, GF109203X inibisce PKC alfa, beta, delta, epsilon, teta e mu e la rottlerina é un inibitore abbastanza specifico per la PKC delta. Saggi di attivazione hanno dimostrato che in queste cellule la stimolazione con il peptide W fosforila un peptide substrato della PKC in maniera dose dipendente. Poiché PKC attivata stimola ERK, Ras e Raf in molti tipi cellulari é stato innanzitutto valutato il ruolo di questa kinasi sull’attivazione delle ERK in cellule IMR90 incubate con il peptide. I risultati ottenuti hanno dimostrato che il pretrattamento con Go6983, Go6976, GF109203X e rottlerina attenuano significamente la fosforilazione delle ERK in maniera dose-dipendente. Successivamente é stata analizzata la capacità di questi inibitori di prevenire l’attivazione della NADPH ossidasi. I risultati dimostrano che la rottlerina, Go6976 e GF109203X inibiscono la fosforilazione e la traslocazione sulla membrana di p47phox. In accordo, saggi di attività enzimatica condotti su frazioni di membrana e citosoliche in presenza di NADPH, FAD e ferricitocromo c, hanno dimostrato che tali inibitori prevengono anche la riduzione del citocromo c ad opera dell’anione superossido generato dalla NADPH ossidasi attivata dal peptide W. Sulla base dei risultati ottenuti é stata condotta una analisi mediante western blot per identificare le isoforme di PKC attivate dal peptide W e coinvolte nel processo di attivazione della ossidasi non fagocitica. I risultati ottenuti dimostrano che PKC delta, e non altre isoforme, si attiva traslocando sulla membrana dopo 2’ di incubazione con il peptide W e la sua attivazione é richiesta per il completo funzionamento della NADPH ossidasi. Infatti, saggi di produzione di ROS hanno dimostrato che la loro generazione da parte della ossidasi non fagocitica é prevenuta dall’incubazione con gli inibitori di PKC, in particolare dalla rottlerina.

Identificazione dei meccanismi di attivazione di una NADPH ossidasi non fagocitica da parte dei formil peptidi

AMMENDOLA, ROSARIO
2003

Abstract

Scopo del presente progetto é stata la dettagliata caratterizzazione dei pathway molecolari implicati nell’attivazione della NADPH ossidasi espressa in fibroblasti umani dopo stimolazione con peptidi formilati (N-fMLP) e non, nonché l’analisi di geni differenzialmente espressi in seguito a tale trattamento. L’approccio sperimentale utilizzato in questi studi é consistito nella stimolazione di fibroblasti umani IMR90 deprivati di siero, che esprimono una macchina molecolare simile alla NADPH ossidasi, con concentrazioni e tempi diversi di N-fMLP che rappresenta un forte attivatore della NADPH ossidasi fagocitica. E’ stata valutata la capacità dei formil-peptidi di attivare l’ossidasi mediante saggi di attività enzimatica ed analisi, mediante western blot, della subunità regolatoria citosolica p47phox della NADPH ossidasi, I risultati ottenuti dimostano che in seguito a tale trattamento si osserva i) una rapida attivazione della NADPH ossidasi, inibibile dalla superossido dismutasi; ii) la fosforilazione e la traslocazione sulla membrana di p47phox, che rappresenta l' evento necessario richiesto per l’attivazione di questa macchina molecolare. Inoltre, la pre-incubazione con PD098059, un inibitore di MEK1, prima della stimolazione previene completamente i fenomeni osservati suggerendo il coinvolgimento delle ERK in questi eventi. Abbiamo infatti successivamente dimostrato che in fibroblasti umani IMR90 deprivati di siero, concentrazioni micromolari di N-fMLP inducono una rapida fosforilazione/attivazione di ERK1/2, misurata in esperimenti di western blot condotti con un anticorpo anti-fosfoERK e che questa è completamente prevenuta da PD098059. In cellule fagocitiche N-fMLP interagisce con almeno due tipi di recettore, uno ad alta affinità (FPR) e l’altro a bassa affinità (FPRL1), ed attiva una cascata di segnali, mediati da proteine G eterotrimeriche sensibili alla tossina della pertosse (PTX), che conduce alla migrazione cellulare, alla fagocitosi, al rilascio di mediatori pro-infiammatori ed alla generazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) via attivazione della NADPH ossidasi. Fibroblasti umani IMR90 deprivati di siero sono stati quindi preincubati con PTX prima della stimolazione con N-fMLP ed esperimenti condotti su estratti proteici purificati da queste cellule hanno dimostrato che PTX è in grado i) di inibire la fosforilazione delle ERK da parte del formil-peptide; ii) di prevenire l’attivazione NADPH-dipendente della NADPH ossidasi non fagocitica; iii) di inibire la fosforilazione e la traslocazione sulla membrana della subunità catalitica p47phox. Questi esperimenti suggeriscono che N-fMLP é capace di attivare la NADPH ossidasi via proteine G sensibili a PTX e che le cellule IMR90 esprimono recettori specifici per formil-peptidi. E’ stata quindi analizzata l’espressione in queste cellule del recettore FPR e FPRL1 mediante esperimenti di RT-PCR condotti su RNA totale purificato da cellule IMR90 ed utilizzando primer specifici. I risultati ottenuti hanno dimostrato che queste cellule esprimono soltanto il recettore a bassa affinità FPRL1 il quale é noto mostrare una più alta affinità per l’esapeptide WKYMVm (peptide W) rispetto a N-fMLP. Esperimenti condotti utilizzando il peptide W hanno infatti dimostrato la sua capacità di indurre una significativa attivazione delle ERK e la traslocazione sulla membrana di p47phox a concentrazioni più basse rispetto a quelle utilizzate per N-fMLP. Mediante saggi di legame al recettore, condotti con WKYMVm iodinato, é stato anche analizzato il legame specifico del peptide W su FPRL1. I risultati hannno dimostrato che sulla membrana dei fibroblasti umani sono espressi siti di legame per il peptide W i quali sono specificamente spiazzati da concentrazioni crescenti di peptide non marcato. Inoltre, l’analisi dei dati di binding hanno consentito di predirre una costante di dissociazione di 160 nM ed una densità di circa 16200 molecole di recettore/cellula. Tale recettore é biologicamente funzionale. Infatti, FPRL1, opportunamente clonato in un vettore di espressione eucariotica, é stato trasfettato in cellule HEK293 prima della stimolazione con N-fMLP (o con WKYMVm). Tali cellule esprimono NOX4, un membro della famiglia delle NADPH ossidasi non fagocitiche, ma non recettori per i formil-peptidi. La determinazione della produzione di anione superossido NADPH-dipendente, misurata come velocità di riduzione del citocromo c sensibile alla superossido dismutasi, ha dimostrato che in HEK293 trasfettate con FPRL1 è possibile misurare un significativo aumento di ROS, mentre nessun effetto è rivelabile nelle cellule trasfettate con il plasmide di controllo. Nelle cellule polimorfonucleate l’interazione tra i formil-peptidi ed i rispettivi recettori serpentinici accoppiati a proteine G eterotrimeriche attiva la fosfolipasi Cbeta che genera inositolo 1,4,5-trifosfato e diacil-glicerolo. La proteina kinasi C (PKC) così attivata é responsabile della fosforilazione di residui di serina (diversi da quelli che sono bersaglio delle ERK) della subunità regolatoria p47phox della NADPH ossidasi. E’ stato quindi valutato il ruolo delle PKC sull’attivazione della ossidasi non fagocitica in cellule IMR90, utilizzando inibitori specifici delle varie isoforme della famiglia di PKC (Go6983, Go6976, GF109203X e rottlerina). Go6976 inibisce preferenzialmente PKC alfa, beta e mu, Go6983 inibisce PKC alfa, beta, gamma, delta e teta, GF109203X inibisce PKC alfa, beta, delta, epsilon, teta e mu e la rottlerina é un inibitore abbastanza specifico per la PKC delta. Saggi di attivazione hanno dimostrato che in queste cellule la stimolazione con il peptide W fosforila un peptide substrato della PKC in maniera dose dipendente. Poiché PKC attivata stimola ERK, Ras e Raf in molti tipi cellulari é stato innanzitutto valutato il ruolo di questa kinasi sull’attivazione delle ERK in cellule IMR90 incubate con il peptide. I risultati ottenuti hanno dimostrato che il pretrattamento con Go6983, Go6976, GF109203X e rottlerina attenuano significamente la fosforilazione delle ERK in maniera dose-dipendente. Successivamente é stata analizzata la capacità di questi inibitori di prevenire l’attivazione della NADPH ossidasi. I risultati dimostrano che la rottlerina, Go6976 e GF109203X inibiscono la fosforilazione e la traslocazione sulla membrana di p47phox. In accordo, saggi di attività enzimatica condotti su frazioni di membrana e citosoliche in presenza di NADPH, FAD e ferricitocromo c, hanno dimostrato che tali inibitori prevengono anche la riduzione del citocromo c ad opera dell’anione superossido generato dalla NADPH ossidasi attivata dal peptide W. Sulla base dei risultati ottenuti é stata condotta una analisi mediante western blot per identificare le isoforme di PKC attivate dal peptide W e coinvolte nel processo di attivazione della ossidasi non fagocitica. I risultati ottenuti dimostrano che PKC delta, e non altre isoforme, si attiva traslocando sulla membrana dopo 2’ di incubazione con il peptide W e la sua attivazione é richiesta per il completo funzionamento della NADPH ossidasi. Infatti, saggi di produzione di ROS hanno dimostrato che la loro generazione da parte della ossidasi non fagocitica é prevenuta dall’incubazione con gli inibitori di PKC, in particolare dalla rottlerina.
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