In questa tesi di dottorato viene dimostrato che due proteine, Ebp1 e DRBP76/NF90 legano le regioni 3’UTR degli mRNA per gli antigeni MHC di classe II (HLA-DRA, HLA-DRB1 e HLA-DQA1). Esperimenti di silenziamento delle due proteine hanno permesso di studiare il loro ruolo funzionale nella regolazione dei messaggeri per MHC-II . Gli esperimenti hanno fornito le seguenti evidenze. 1) Il silenziamento degli mRNA codificanti le proteine EBP1 e NF90 determina una diminuzione degli mRNA totali per gli MHC-II. Tale diminuzione può essere spiegata da una funzione a livello trascrizionale da parte di entrambe le proteine. Molti lavori pubblicati indicano che la funzione del transattivatore dei geni per gli MHC-II, CIITA, è inibita dalle HDAC (Histone deacetylase) e questa azione richiede un corepressore delle HDAC, sin3A. Inoltre è stato trovato che EBP1 inibisce la trascrizione dei geni del recettore degli androgeni interagendo con HDAC e sin3A. Si può ipotizzare che EBP1 interagisca e sequestri le HDAC, le quali, distaccandosi dal promotore, consentirebbero l’interazione del transattivatore CIITA e la trascrizione dei geni per MHC-II. Invece quando viene silenziata EBP1, diminuisce il suo legame con le HDAC, le quali possono legare il promotore inibendo la trascrizione. Diversamente è già stato dimostrato che NF90 legherebbe il primo introne del gene HLA-DRA modulando negativamente l’espressione di HLA-DRA. 2) La riduzione delle proteine EBP1 ed NF90 genera un incremento della stabilità dei trascritti per MHC-II. Tale risultato indica che le proteine agirebbero anche a livello post-trascrizionale destabilizzando i messaggeri per MHC-II. 3) La diminuzione di entrambe le isoforme NF90 e NF110 non causa variazione della quantità totale dei messaggeri né della loro emivita. Quindi i risultati indicano un ruolo differente delle isoforme NF90 e NF110. NF90 agirebbe in eventi di regolazione trascrizionali e post-trascrizionali, mentre ad NF110 si può attribuire una funzione nella modulazione dei trascritti per MHC-II a livello post-trascrizionale, forse nella regolazione del trasporto da nucleo a citoplasma. 4) I risultati ottenuti da esperimenti di trasfezione e silenziamento dei messaggeri codificanti le catena alfa e beta dell’eterodimero HLA-DR mostrano che l’iper-espressione di uno dei due messaggeri genera un aumento anche dell’altro, mentre la riduzione di uno dei due messaggeri causa diminuzione dell’altro. Sembra quindi che tali trascritti siano fisicamente associati e coregolati durante il processing nel citoplasma grazie al legame con le stesse proteine. L’accoppiamento di eventi di regolazione trascrizionali e post-trascrizionali potrebbe garantire un’espressione coordinata delle molecole MHC-II, permettendo all’occorrenza di rispondere rapidamente ad uno stimolo esterno, ma anche di bloccarne l’espressione degradando le molecole di mRNA velocemente attraverso una modulazione della stabilità (come avviene per i messaggeri istonici ). 5) Infine, i risultati permettono di ipotizzare che Ebp1 ed le NFAR (NF90 e NF110) potrebbero far parte di uno stesso complesso RNP, in grado di regolare l’espressione dei messaggeri codificanti le due catene. Tali proteine, già note per legare regioni di double strand RNA, potrebbero interagire con una struttura secondaria e/o fattori con attività in cis condivisi dalla 3’UTR degli mRNA MHC-II. Questa ipotesi suggerirebbe che gli mRNA degli antigeni MHC- II, codificanti molecole diverse ma con la stessa funzione di presentazione dell’antigene, potrebbero far parte di un medesimo “operone a RNA”.

Identificazione di proteine con attività di legame agli mRNA degli antigeni MHC di classe II

ABRESCIA, PAOLO
2010

Abstract

In questa tesi di dottorato viene dimostrato che due proteine, Ebp1 e DRBP76/NF90 legano le regioni 3’UTR degli mRNA per gli antigeni MHC di classe II (HLA-DRA, HLA-DRB1 e HLA-DQA1). Esperimenti di silenziamento delle due proteine hanno permesso di studiare il loro ruolo funzionale nella regolazione dei messaggeri per MHC-II . Gli esperimenti hanno fornito le seguenti evidenze. 1) Il silenziamento degli mRNA codificanti le proteine EBP1 e NF90 determina una diminuzione degli mRNA totali per gli MHC-II. Tale diminuzione può essere spiegata da una funzione a livello trascrizionale da parte di entrambe le proteine. Molti lavori pubblicati indicano che la funzione del transattivatore dei geni per gli MHC-II, CIITA, è inibita dalle HDAC (Histone deacetylase) e questa azione richiede un corepressore delle HDAC, sin3A. Inoltre è stato trovato che EBP1 inibisce la trascrizione dei geni del recettore degli androgeni interagendo con HDAC e sin3A. Si può ipotizzare che EBP1 interagisca e sequestri le HDAC, le quali, distaccandosi dal promotore, consentirebbero l’interazione del transattivatore CIITA e la trascrizione dei geni per MHC-II. Invece quando viene silenziata EBP1, diminuisce il suo legame con le HDAC, le quali possono legare il promotore inibendo la trascrizione. Diversamente è già stato dimostrato che NF90 legherebbe il primo introne del gene HLA-DRA modulando negativamente l’espressione di HLA-DRA. 2) La riduzione delle proteine EBP1 ed NF90 genera un incremento della stabilità dei trascritti per MHC-II. Tale risultato indica che le proteine agirebbero anche a livello post-trascrizionale destabilizzando i messaggeri per MHC-II. 3) La diminuzione di entrambe le isoforme NF90 e NF110 non causa variazione della quantità totale dei messaggeri né della loro emivita. Quindi i risultati indicano un ruolo differente delle isoforme NF90 e NF110. NF90 agirebbe in eventi di regolazione trascrizionali e post-trascrizionali, mentre ad NF110 si può attribuire una funzione nella modulazione dei trascritti per MHC-II a livello post-trascrizionale, forse nella regolazione del trasporto da nucleo a citoplasma. 4) I risultati ottenuti da esperimenti di trasfezione e silenziamento dei messaggeri codificanti le catena alfa e beta dell’eterodimero HLA-DR mostrano che l’iper-espressione di uno dei due messaggeri genera un aumento anche dell’altro, mentre la riduzione di uno dei due messaggeri causa diminuzione dell’altro. Sembra quindi che tali trascritti siano fisicamente associati e coregolati durante il processing nel citoplasma grazie al legame con le stesse proteine. L’accoppiamento di eventi di regolazione trascrizionali e post-trascrizionali potrebbe garantire un’espressione coordinata delle molecole MHC-II, permettendo all’occorrenza di rispondere rapidamente ad uno stimolo esterno, ma anche di bloccarne l’espressione degradando le molecole di mRNA velocemente attraverso una modulazione della stabilità (come avviene per i messaggeri istonici ). 5) Infine, i risultati permettono di ipotizzare che Ebp1 ed le NFAR (NF90 e NF110) potrebbero far parte di uno stesso complesso RNP, in grado di regolare l’espressione dei messaggeri codificanti le due catene. Tali proteine, già note per legare regioni di double strand RNA, potrebbero interagire con una struttura secondaria e/o fattori con attività in cis condivisi dalla 3’UTR degli mRNA MHC-II. Questa ipotesi suggerirebbe che gli mRNA degli antigeni MHC- II, codificanti molecole diverse ma con la stessa funzione di presentazione dell’antigene, potrebbero far parte di un medesimo “operone a RNA”.
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11588/372523
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