Studio del ruolo della proteina AKAP121 nel controllo della funzionalità mitocondriale in modelli cellulari di anossia/reossigenazione come bersaglio per lo sviluppo di molecole di potenziale impiego terapeutico nell'ischemia cerebrale

I mitocondri sono gli organuli intracellulari deputati alla conversione dell’energia in forme utili a promuovere le reazioni indispensabili per le funzioni cellulari. Il gradiente elettrochimico a cavallo della membrana mitocondriale interna è fondamentale per il corretto funzionamento di tale organulo. Inoltre, grazie al mantenimento del potenziale di membrana i mitocondri sono in grado di regolare l’omeostasi del calcio intracellulare, rappresentando il principale compartimento di deposito di calcio all’interno della cellula stessa. L’accumulo di calcio nella matrice è, infatti, indispensabile per il corretto funzionamento degli enzimi mitocondriali. Tuttavia in situazioni che determinano un eccessivo accumulo di tale ione all’interno della cellula, quali quelle che si verificano in seguito al manifestarsi di un insulto ischemico, il mitocondrio perde la sua proprietà di accumulare lo ione calcio con conseguente alterazione della permeabilità di membrana a molecole potenzialmente dannose per la cellula stessa. Tutto ciò contribuisce a compromettere ulteriormente il potenziale di membrana mitocondriale e conseguentemente la funzione del mitocondrio stesso con attivazione del processo di morte cellulare. Tra le proteine mitochondriali che ne regolano le funzioni, particolare attenzione è stata rivolta negli ultimi anni alle AKAPs, una famiglia di proteine deputate all’ancoraggio della Protein Kinasi A (PKA) alla membrana di specifici compartimenti cellulari amplificando gli effetti biologici dei segnali mediati dalla via del cAMP. In particolare, la proteina AKAP121 è responsabile del reclutamento della PKA sulla membrana mitocondriale esterna. E’ stato dimostrato che l’ancoraggio della PKA al mitocondrio potenzia la trasduzione del segnale mediato dal cAMP e sopprime l’apoptosi indotta dalla deprivazione di siero in cellule PC12. Questi effetti sono dovuti al potenziamento del segnale del cAMP-PKA al mitocondrio con conseguente fosforilazione della proteina proapoptotica BAD a livello della serina 155, inibizione del rilascio di citocromo-c dal mitocondrio e protezione delle cellule dall’apoptosi indotta dalla deprivazione di siero. Sulla base di tale premessa il presente progetto di ricerca si propone di studiare il ruolo della proteina AKAP121 nel processo neurodegenerativo indotto dall’insulto anossico/ischemico, con particolare attenzione al suo ruolo nella regolazione della funzione mitocondriale e agli effetti della modulazione farmacologica dell’attività della proteina AKAP 121 sulla sopravvivenza cellulare durante l’evento ischemico. Inoltre, una volta chiarito il coinvolgimento della proteina AKAP 121 nella regolazione della funzione mitocondriale durante il processo anossico/ischemico, si cercherà di identificare il bersaglio mitocondriale di AKAP121 al fine di caratterizzarne ulteriormente il suo meccanismo di azione. Tali problematiche sperimentali saranno affrontate utilizzando linee cellulari continue HEK293 di controllo e transfettate con AKAP-121, sia in maniera transiente che stabilmente, le quali verranno sottoposte al trattamento con oligomicina e 2-deossi-glucosio (2DG), una condizione che causando una diminuizione della produzione dei livelli di ATP determina la compromissione della funzione mitocondriale. Per l’identificazione del bersaglio molecolare di AKAP121 si utilizzeranno cellule renali BHK stabilmente transfettate con ciascuna delle isoforme dello scambiatore Na+/Ca2+ di membrana, NCX1, NCX2 e NCX3 e co-trasfettate con AKAP 121. Infine, per chiarire il ruolo svolto da AKAP-121 in condizioni patologiche quali l’ischemia cerebrale, si procederà allo studio della localizzazione e della funzione di tale proteina a livello di popolazioni neuronali provenienti da differenti aree cerebrali esposte a deprivazione di ossigeno e Glucosio (OGD) seguita da riossigenazione.