2007XKCCWF_002Ruolo della sfingosina-1-fosfato (S1P) nell'infiammazione delle vie respiratorie e nella iper-responsività in topi sensibilizzati con ovalbumina: studi in vitro

L’osservazione che i livelli di sfingosina-1-posfato (S1P) risultano aumentati nel lavaggio broncoalveolare di soggetti asmatici dopo stimolazione con antigene, ha portato a considerare la S1P un importante mediatore, di origine mastocitaria, nella complessa serie di eventi infiammatori osservati nella reazioni allergiche ed asmatiche. Studi effettuati su animali deficienti per il recettore S1P1 hanno dimostrato che l’attivazione di tale recettore da parte della S1P è essenziale per una ricircolazione dei linfociti T dagli organi linfoidi secondari ai tessuti periferici, lì dove si sviluppa l’evento infiammatorio. I mastociti esprimono sia il recettore S1P1 che S1P2 sulla loro superficie ed, analogamente ai linfociti T, il sottotipo S1P1 risulta essenziale per la chemiotassi dei mastociti. Al contrario il sottotipo recettoriale S1P2 l’attivazione e la degranulazione mastocitaria. Una volta che i mastociti rilasciano S1P, essa può agire su i suoi propri recettori espressi sulla membrana dei mastociti stessi, ed attraverso un feedback positivo, potenziare le funzioni dei mastociti. Inoltre, noi ed altri abbiamo dimostrato che la S1P induce contrazione della muscolatura liscia ed aumenta la concentrazione intracellulare di calcio attraverso l’attivazione dei sottotipi recettoriali S1P2 o S1P3. Recentemente noi abbiamo accumulato una serie di evidenze sperimentali che indicano un ruolo attivo della via di trasduzione della S1P nei meccanismi molecolari alla base della iperreattività delle vie aeree. Un’esposizione prolungata a basse concentrazioni di S1P incrementa fortemente la contrazione indotta da acetilcolina. Inoltre abbiamo evidenziato, attraverso l’utilizzo di bronchi e polmoni isolati, che la S1P induce iperreattività delle vie aeree in topi sensibilizzati con ovoalbumina. Il pretrattamento dei topi sensibilizzati con albumina, con uno specifico inibitore della S1P chinasi, riduce l’iperreattività delle vie aeree indotta da ovalbumina. Questi dati suggeriscono che una modulazione negativa dei livelli di S1P può riflettersi sulla reattività bronchiale sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Scopo di questo progetto di ricerca è quello di chiarire il ruolo della S1P nella reattività bronchiale sia in condizioni fisiologiche che patologiche attraverso un approccio molecolare e funzionale, sia in vitro che in vivo.La nostra unità di ricerca effettuerà degli esperimenti specifici su organi isolati (bronchi e/o trachea) prelevati da topi sensibilizzati all’allergene (ovoalbumina) in presenza ed in assenza di S1P, dove saranno determinati: i) le risposte funzionali ii)le vie di trasduzione coinvolte. Inoltre sarà interessante valutare se la somministrazione sistemica di S1P è capace di modulare l’iperreattività indotta dall’ovalbumina o la risposta infiammatoria. La muscolatura lisca esprime i sottotipi recettoriali S1P1, S1P2 e S1P3, pertanto verrà testata anche la capacità della S1P di alterare il tono bronchiale in tessuti prelevati da topi trattati come descritto. Il nostro interesse sarà inoltre rivolto allo studio dei meccanismi di trasduzione specifici coinvolti utilizzando opportuni strumenti farmacologici. Sarà valutato il contributo della S1P endogena attraverso l’inibizione dell’enzima S1Pchinasi e il ruolo della produzione basale di tale mediatore sulla regolazione del tono bronchiale. Valuteremo inoltre l’espressione dei recettori della S1P (S1P1-5) e della SPK (1-2) su tessuti bronchiali di topo prelevati da topi trattati come descritto in precedenza. Poiché è noto che la S1P è in grado di modulare l’attività della eNOS e l’espressione della COX-2, enzimi direttamente coinvolti nell’asma, saranno valutati il oro livelli di espressione e di attività. In collaborazione con le altre unità, verranno effettuati esperimenti di RT-PCR che daranno informazioni sui livelli di mRNA per tutti i recettori della S1P e sulle SPK e sulle citochine e chemochine coinvolte nella risposta evocata dall’allergene. Sempre in collaborazione, mediante valutazioni del BAL saranno effettuate analisi del fenotipo cellulare reclutato dopo stimolazione con allergene. Le cellule così ottenute saranno utilizzate per l’analisi di western blot al fine di indagare sull’espressione dei recettori della S1P e delle SPK. Per approfondire lo studio della S1P nella reazione infiammatoria associata alla risposta allergica sarà utilizzato un altro modello di infiammazione in vivo quale l’air pouch dopo sensibilizzazione con ovalbumina.