Bioconversione di composti aromatici mediante microrganismi liberi o immobilizzati

L’attività riguarda lo studio delle bioconversioni di composti aromatici. In particolare è stata evidenziata la capacità di Pseudomonas stutzeri OX1 di mineralizzare composti aromatici (fenoli, cresoli, xileni) e di convertire coloranti organici in soluzione. Le peculiari caratteristiche metaboliche di P. stutzeri OX1 lo rendono sicuramente un buon candidato per applicazioni in campo biotecnologico Il successo dei processi biotecnologici su larga scala è condizionato non solo dalla soddisfacente attività biologica ma anche dalla scelta opportuna di sistemi reattoristici che ne esaltino le prestazioni. I reattori impiegati per i processi di bioconversione mediante microrganismi, liberi o immobilizzati, sono tipicamente reattori trifasici a letto fluidizzato. I reattori con cellule batteriche immobilizzate offrono numerosi vantaggi rispetto alla soluzione con biomassa libera, tra questi i più rilevanti sono: i) la possibilità di aumentare la portata alimentata senza assistere all’allontanamento (wash-out) del microrganismo; ii) la possibilità di regolare la concentrazione batterica agendo sulla massa del solido inerte adottato per l’immobilizzazione. Tra le metodologie di immobilizzazione risulta particolarmente diffusa l’adsorbimento su solidi granulari inerti con formazione di biofilm. L’attività di ricerca è stata finalizzata allo studio delle prestazioni di biofilm di P. stutzeri OX1 su supporti solidi granulari per impiego in reattori trifasici della tipologia airlift a circolazione interna. E’ stata data particolare enfasi allo studio di parametri quali: la cinetica di formazione del biofilm, l’estensione del biofilm sulla superficie del carrier, la morfologia, la struttura e lo spessore dello stesso. Il principale obiettivo del presente lavoro è stato la ricerca e a messa a punto di tecniche diagnostiche atte allo studio di biofilm. Inoltre si è proceduto alla caratterizzazione del processo di conversione di due sostanze tipo, quali il fenolo e un azo-colorante. L’attività sperimentale ha previsto: i) la caratterizzazione della cinetica di crescita del microrganismo in fase libera in entrambi i sistemi reattoristici adottati (beute e airlift); ii) la selezione di solidi granulari inerti da adottare negli esperimenti di immobilizzazione; iii) la messa a punto di un protocollo di immobilizzazione; iv) la messa a punto di tecniche diagnostiche qualitative e quantitative per lo studio sistematico del biofilm e per la definizione delle sue principali caratteristiche; v) la scelta delle condizioni operative ottimali per valutare le prestazioni e la stabilità di biofilm in reattori trifasici. I risultati ottenuti dalle prove di immobilizzazione in beuta hanno permesso di selezionare quali supporti idonei le pomici naturali e la sabbia silicea, i primi rappresentativi di solidi porosi mentre i secondi di solidi impervi. Le tecniche diagnostiche risultate idonee e affidabili per la caratterizzazione qualitativa sono: il saggio di PCR, le osservazioni al microscopio elettronico a scansione e al microscopio ottico, lo screening su piastre di terreno solido selettivo. Tra le tecniche quantitative risultano idonee per le indagini condotte l’analisi elementare (limitatamente al carbonio e all’azoto) e l’elaborazione delle immagini ottenute al microscopio ottico. Le prove di immobilizzazione condotte in airlift sono state finalizzate alla caratterizzazione dei principali parametri cinetici di crescita del microrganismo in fase immobilizzata. Inoltre sono state determinate le condizioni operative per la crescita e l’analisi di biofilm di P. stutzeri OX1. Numerose prove condotte con pomici naturali in airlift sono state finalizzate allo studio degli effetti delle condizioni operative sulle caratteristiche del biofilm e della capacità dello stesso di sopportare sollecitazioni chimico-fisiche. In particolare sono stati indagati gli effetti della concentrazione fenolica e della portata della corrente alimentata all’airlift. La crescita, l’estensione e la struttura del biofilm sono state studiate con le tecniche diagnostiche sopra citate. In particolare dalle micrografie SEM si evincono alcune caratteristiche morfologiche del biofilm: i) il biofilm risulta essere localizzato principalmente negli “anfratti” delle particelle, dove sono più contenuti i fenomeni di shear; ii) il biofilm è caratterizzato da una struttura continua aderente alle pareti dei pori; iii) la struttura del biofilm sembrerebbe multi-layer. Dalle immagini riprese al microscopio ottico delle particelle campioni è possibile rilevare che la superficie esterna delle particelle è coperta da materiale trasparente alla luce, assente intorno a particelle delle stesse dimensioni non incubate. Lo spessore del biofilm esterno risulta essere di circa 30 m. La stima della massa di cellule immobilizzate sulle particelle presenti nell’airlift è stata condotta seguendo due procedure: la prima è basata sull’elaborazione delle misure di composizione elementare. In particolare si è assunto che: i) l’incremento del tenore di azoto sia dovuto solo al contributo delle cellule immobilizzate (assenza di composti azotati nella matrice extracellulare); ii) il rapporto carbonio/azoto nelle cellule immobilizzate sia uguale a quello caratteristico delle cellule in fase libera. In tali ipotesi si è proceduto a calcolare la massa cellulare immobilizzate nel biofilm ed è risultata di circa l’85% della massa carboniosa presente nel biofilm. La seconda procedura si basa su una metodologia prettamente reattoristica. I dati di conversione del fenolo, misurati in condizioni di regime stazionario, sono stati riportati in funzione della portata alimentata fornendo il diagramma noto come curva di break-through. Nell’ipotesi che il modello di conversione del fenolo stimato per le cellule in fase libera sia estendibile al biofilm, la massa cellulare è stimabile dalla curva di break-through. Il sistema di cellule immobilizzate di Pseudomonas stutzeri OX1 in airlift è stato utilizzato per lo studio del processo di conversione di due sostanze aromatiche modello: il fenolo e un colorante organico, l’Acid Orange 7. In entrambi i casi sono stati determinati i principali parametri e modelli cinetici e confrontati rispettivamente con risultati ottenuti con cellule dello stesso microrganismo in fase libera.