Aspetti sintetici e caratterizzazione chimico-fisica di quadruple eliche di DNA: studio dell'interazione con farmaci e sviluppo di nuovi aptameri, come potenziali agenti antitumorali e/o antivirali, a struttura oligonucleotidica

Questo progetto di ricerca è indirizzato alla progettazione, alla sintesi e allo studio delle proprietà chimico-fisiche di oligonucleotidi di nuova generazione capaci di formare strutture a quadrupla elica di DNA (G-quadruplex). Lo studio di sistemi modello in grado di strutturarsi in G-quadruplex è finalizzato ad applicazioni nei seguenti ambiti di ricerca: 1) chiarire il ruolo biologico delle quadruple eliche di DNA in vivo; 2) identificare possibili “target”, sia in terapie anticancro, in particolare contro la telomerasi, sia in approcci contro il virus HIV-1; 3) progettare su una base razionale e sintetizzare nuove molecole a struttura oligonucleotidica farmacologicamente attive. Il principale motivo di interesse per le strutture a quadrupla elica del DNA è legato allo studio dei telomeri ed alla inibizione delle telomerasi per sviluppare efficaci terapie antitumorali. Il DNA telomerico, situato all’estremità dei cromosomi, si presenta nella regione 3’-terminale come singolo filamento che termina con la sequenza nucleotidica d(5’TTAGGG3’), ripetuta n volte, in grado di formare strutture a quadrupla elica. In generale, nei processi di duplicazione cellulare si registra un accorciamento dei telomeri, correlato con i normali processi di invecchiamento cellulare. Un enzima, la telomerasi, controbilancia in parte questo effetto, sintetizzando nuovamente le sequenze ricche di guanine del DNA telomerico. Le telomerasi, superespresse nella maggior parte delle forme tumorali note, sono direttamente coinvolte nello sviluppo del cancro, in quanto consentono alle cellule cancerose di sfuggire alla “morte” cellulare programmata. Esperimenti in vitro hanno dimostrato che la formazione di strutture quadruplex in sequenze di DNA telomerico inibisce l’attività telomerasica, indicando le strategie finalizzate alla stabilizzazione di complessi quadruplex in vivo come un promettente approccio antitumorale. Una parte di questo progetto è rivolto alla sintesi di oligonucleotidi derivanti da diversi troncamenti del DNA telomerico umano, capaci di formare strutture a quadrupla elica, e allo studio degli aspetti energetici (termodinamici e cinetici) legati alla formazione delle quadruple eliche e della loro interazione con potenziali farmaci. Fino ad oggi, la maggior parte degli studi sulle proprietà delle quadruple eliche e sulle loro interazioni con molecole di interesse farmacologico sono stati condotti sulla sequenza telomerica umana formata da quattro unità ripetitive d(5’TTAGGG3’)4, in grado di formare una sola quadrupla elica. Poiché il DNA telomerico è costituito dalla sequenza d(5’TTAGGG3’) ripetuta n volte, allo scopo di ottenere un modello più aderente al sistema che potenzialmente si realizza in vivo, il seguente progetto di ricerca prevede lo studio di sequenze telomeriche più lunghe, in grado di formare in serie più strutture a quadrupla elica, e della loro interazione con molecole in grado di incrementarne la stabilità. Come ligandi saranno studiati la distamicina e alcuni suoi analoghi, la porfirina e nuovi derivati del coronene e del perilene, la cui sintesi sarà effettuata presso l’Unità Operativa di Roma. Tali studi permetteranno di stabilire se i dati raccolti sulla sequenza telomerica corta sono utili per predire le proprietà della sequenze più lunghe. Lo studio dell’energetica delle interazioni delle quadruple eliche con i differenti ligandi, volto alla determinazione della stechiometria di legame e dei parametri termodinamici relativi al processo di associazione, sarà condotto sfruttando tecniche di calorimetria isoterma (ITC), NMR ed altre tecniche spettroscopiche quali il dicroismo circolare. Altro motivo di interesse per i complessi quadruplex di DNA è legato allo sviluppo di aptameri come potenziali antivirali. In particolare, oligonucleotidi ricchi in guanine si sono rivelati efficaci inibitori in vitro del virus HIV-1, legandosi specificamente alla glicoproteina gp120 di HIV, coinvolta nel processo di fusione cellulare. In questo quadro, un’altra linea di ricerca riguarderà la sintesi e la caratterizzazione chimico-fisica di oligonucleotidi di sequenza d(5’TGGGAG3’) in grado di formare strutture quadruplex. Su questa sequenza saranno realizzate diverse modifiche terminali, quali l’introduzione di residui di mono- o disaccaridi in posizione 3’ e/o 5’. La glicoconiugazione delle sequenze in esame consente di aumentare la resistenza in vivo degli oligonucleotidi alle nucleasi e di favorirne la penetrazione cellulare, sfruttando specifici meccanismi di riconoscimento con le lectine. La stabilità termodinamica delle strutture quadruplex modificate sarà studiata mediante analisi di denaturazione termica utilizzando tecniche di dicroismo circolare e di calorimetria differenziale a scansione (DSC). Studi di analisi conformazionale in soluzione saranno effettuati mediante tecniche NMR, integrate con metodi di meccanica e dinamica molecolare, in collaborazione con le altre Unità afferenti a questo progetto.