Un approccio di proteomica funzionale allo studio dei meccanismi molecolari di chemioresistenza ed invasività nelle cellule staminali tumorali.

Le cellule tumorali staminali sono caratterizzate da un limitato potenziale proliferativo e da un’elevata espressione di proteine anti-apoptotiche che le rendono insensibili alle convenzionali terapie antitumorali consentendo la ricomparsa del tumore anche dopo il trattamento. In questo contesto, un ruolo chiave è ricoperto da fattori in grado di stimolare la resistenza delle cellulare tumorali staminali ai chemioterapici, come la produzione autocrina di interleuchina 4 (IL-4) ed il recettore di IL-4 che controllano la sopravvivenza, la crescita e la resistenza ai chemioterapici delle cellule tumorali staminali attraverso l’attivazione di specifiche vie di traduzione del segnale. L’espressione di specifiche varianti di “splicing” del fattore CD44 (CD44v) costituisce un’ulteriore peculiare caratteristica delle cellule staminali tumorali, ed in particolare le varianti CD44v5 e CD44v6 sono strettamente correlate all’invasività aumentando in vivo i potenziali tumorigenici e di formazione di metastasi. L’espressione di queste specifiche varianti di “splicing” è indotta da segnali extracellulari, inclusi HGF ed EGF mediante un meccanismo che coinvolge Sam68, una proteina che lega l’RNA regolando lo “splicing” alternativo nell’espressione di vari geni. La produzione di CD44v6 genera un meccanismo a "feed forward" positivo in cui l’attivazione del segnale proliferativo di HGF dipende dalla precoce induzione dell'espressione di CD44v6. Recentemente è stato dimostrato che la Diacilglicerolo Chinasi (Dgka), una lipide chinasi che media la trasduzione del segnale proliferativo e invasivo di fattori di crescita tra cui HGF, EGF e VEGF, interagisce con varie proteine che legano l’RNA e rimodellano la cromatina coinvolte nella regolazione dello “splicing” di CD44, tra cui Sam68, numerose subunità del complesso SW1/SNF e dello splisosoma U2. L’attività scientifica di questa Unità sarà quindi indirizzata allo studio dei meccanismi molecolari coinvolti nella sopravvivenza ed invasività delle cellule staminali tumorali usando approcci di proteomica funzionale. In particolare, l’identificazione dei singoli fattori proteici responsabili della regolazione dell’espressione di IL-4 o dello “splicing” alternativo di CD44 verrà realizzata con esperimenti di proteomica funzionale essenzialmente basati su strategie di purificazioni per affinità in differenti condizioni sperimentali. La sequenza nucleotidica del promotore del gene di IL-4 o quella contenente i siti di legame a proteine dell’esone 5 di CD44 verrà immobilizzata su un supporto inerte ed usata come esca nella cattura degli specifici interattori a partire dall’estratto proteico proveniente da cellule tumorali staminali o da cellule modello da colon T84, preparato in assenza ed in presenza di stimolazione da HGF e/o IL-4. I componenti proteici dei complessi così purificati verranno quindi frazionati mediante elettroforesi mono-dimensionale ed identificati usando metodologie di spettrometria di massa. Le bande proteiche escisse dal gel saranno digerite in situ con tripsina e la risultante miscela peptidica verrà analizzata mediante metodi di cromatografia liquida capillare e spettrometria di massa tandem (nanoLC-MS/MS).