Sintesi e Studi Conformazionali di Oligonucleotidi e Analoghi Atti a Formare Strutture Quadruplex

Il presente progetto di ricerca è imperniato sullo studio di strutture quadruplex del DNA finalizzato alla comprensione del loro ruolo in importanti processi biologici in cui esse sono coinvolte o come parte di una regione del genoma umano o come impalcatura di una piccola molecola di natura oligonucleotidica in grado di interagire con una specifica proteina (aptamero). In entrambi i casi, l’obiettivo fondamentale è la progettazione, la sintesi, la caratterizzazione chimico-fisica e la sperimentazione biologica di nuovi potenziali farmaci diretti verso patologie di natura tumorale o virale per le quali, fino ad ora, non esistono rimedi realmente efficaci. Alla sua realizzazione concorreranno cinque unità operative, tutte da anni impegnate in ricerche aventi come oggetto gli acidi nucleici e in possesso di esperienze diversificate e complementari. Per quanto riguarda la presenza di strutture quadruplex nel DNA naturale, appare ormai certo che esse svolgano un ruolo fondamentale nell’organizzazione dei telomeri. Uno degli obiettivi specifici del programma è, quindi, il rinvenimento di molecole in grado di inibire l’attività della telomerasi, favorendo l’apoptosi di cellule tumorali, attraverso la stabilizzazione di strutture G-quadruplex sul telomero. A tale scopo, saranno sintetizzati oligonucleotidi modello in grado di formare strutture G-quadruplex di diverso tipo per caratterizzare, poi, la stabilità termodinamica dei complessi da esse formati con derivati perilenici e studiare la selettività delle stesse molecole verso il G-quadruplex rispetto al DNA duplex. Inoltre, si intende progettare e sintetizzare nuove molecole che possano risultare più efficienti nell’induzione e stabilizzazione di strutture G-quadruplex e, quindi, nell’inibizione della telomerasi sia in vitro che in vivo. Un altro obiettivo del programma, riguarda l’inibizione dell’oncogene K-ras coinvolto nella progressione tumorale, sfruttando la recentissima indicazione che una struttura quadruplex a funzione regolativa possa formarsi in una zona ricca in G del promotore. Ci si propone, quindi di studiare e caratterizzare questa struttura, individuare le proteine che la legano e catalizzano l’interconversione tra duplex e quadruplex. Questi dati forniranno le basi per procedere verso l’individuazione di molecole a scopo terapeutico saggiando sia molecole organiche che stabilizzino il quadruplex, sia ON aptamerici che saturino i siti di legame della proteina, per bloccare il passaggio del promotore alla forma trascrizionalmente attiva. Per migliorare le caratteristiche farmacocinetiche degli aptameri diretti verso le proteine che regolano l’espressione dell’oncogene k-ras o, eventualmente, di altre proteine, saranno progettati e sintetizzati ON in grado di formare strutture quadruplex e contenenti modifiche strutturali alla base e/o allo scheletro zucchero-fosfato. Ci si propone, in particolare di sintetizzare diverse classi di ON analoghi, tra cui “ON a grappolo” in grado di formare strutture quadruplex monomolecolari caratterizzate da una elevata stabilità e con orientamento dei filamenti predeterminato, ON aventi un segmento di PNA (Peptide Nucleic Acids) legato alla estremità 3' o 5' e ON in grado di strutturarsi in quadruplex coniugati con mono- e oligo-saccaridi o opportuni saccaromimetici. Una volta identificati gli ON più promettenti, si passerà a considerare ulteriori modifiche, quali la coniugazione con molecole in grado di facilitarne il passaggio attraverso le membrane cellulari. In letteratura sono riportate diverse soluzioni per tale problema tra le quali, sicuramente quella basata sulla sintesi e sull’uso di derivati del PEG (polietilenglicole) come molecola carrier risulta tra le più efficienti.