Il locus della caseina as1 (CSN1S1) di capra si caratterizza per almeno 17 alleli associati a diversi livelli di sintesi (da 3,5 a 0,0 g/l per allele). Attualmente sono noti gran parte degli eventi molecolari che li caratterizzano. In particolare, l’allele CSN1S1N, associato ad un contenuto apparentemente nullo di caseina as1, si differenzia dall’allele CSN1S1A per la sola delezione di una C al 23° nt del 9° esone, responsabile della formazione di uno stop codon prematuro al 12°esone, mentre l’associazione di tale mutazione con due inserzioni di 11 e 3 bp nel 9° introne è responsabile del contenuto ridotto (~0,45g/l) associato all’allele F. L’obiettivo del presente lavoro è stato quello di comprendere le basi molecolari responsabili del diverso livello di espressione degli alleli CSN1S1N e F attraverso l’analisi ed il confronto dei trascritti prodotti. L’RNA totale è stato estratto dalle cellule somatiche recuperate dai campioni di latte di tre individui di genotipo CSN1S1AA, CSN1S1FF e CSN1S1NN. Mediante RT-PCR sono stati amplificati i cDNA relativi ai trascritti che codificano per la proteina s1 utilizzando primer disegnati sul 1° e 19° esone. I cDNA ottenuti sono stati clonati, sottoposti a screening e sequenziati. L’analisi dei trascritti prodotti dagli alleli CSN1S1A, F e N ha messo in evidenza la formazione, oltre che di un mRNA correttamente assemblato (87,4%, 12% e 24,5%, rispettivamente), di almeno altre 4, 8 e 11 diverse popolazioni di mRNA. Le popolazioni dolete dell’allele CSN1S1A si caratterizzano per lo splicing alternativo degli esoni 13, 16 e 17, e del 1°codone dell’11°esone, mentre quelle trascritte dagli alleli CSN1S1F e N, per l’assenza dell’esone 9 e/o degli esoni 10, 11, 13, 16 e 17, oltre che del 1° codone dell’11°esone, in diverse combinazioni. In particolare per l’allele N si osserva un’incidenza maggiore dei trascritti caratterizzati da uno stop codon prematuro rispetto all’allele F (~ 30% vs 12%). L’analisi dei trascritti mette in evidenza eventi costitutivi (allele indipendente) che si realizzano durante la maturazione del pre-mRNA: rimozione casuale degli esoni 13, 16 e 17 e rimozione casuale del 1° codone dell’11° esone. Gli eventi, invece, che conducono alla sintesi di trascritti deleti degli esoni 9, 10 e 11 (prodotti dagli alleli CSN1S1 N e F) potrebbero essere la conseguenza di un delicato “meccanismo di sopravvivenza dell’mRNA” che opera nel tentativo di impedire la formazione di proteine “tronche” o inattive, attraverso la “degradazione mediata dal codone nonsenso” di mRNA che contengono stop codon prematuri, conferendo un vantaggio selettivo per la possibile traduzione di proteine parzialmente delete, potenzialmente funzionali attraverso la formazione di trascritti con delezioni che riportano in frame l’mRNA (delezione del 9° esone).

Analisi dei trascritti degli alleli CSN1S1 A, F e N di capra

COSENZA, GIANFRANCO;GALLO, DANIELA
2004

Abstract

Il locus della caseina as1 (CSN1S1) di capra si caratterizza per almeno 17 alleli associati a diversi livelli di sintesi (da 3,5 a 0,0 g/l per allele). Attualmente sono noti gran parte degli eventi molecolari che li caratterizzano. In particolare, l’allele CSN1S1N, associato ad un contenuto apparentemente nullo di caseina as1, si differenzia dall’allele CSN1S1A per la sola delezione di una C al 23° nt del 9° esone, responsabile della formazione di uno stop codon prematuro al 12°esone, mentre l’associazione di tale mutazione con due inserzioni di 11 e 3 bp nel 9° introne è responsabile del contenuto ridotto (~0,45g/l) associato all’allele F. L’obiettivo del presente lavoro è stato quello di comprendere le basi molecolari responsabili del diverso livello di espressione degli alleli CSN1S1N e F attraverso l’analisi ed il confronto dei trascritti prodotti. L’RNA totale è stato estratto dalle cellule somatiche recuperate dai campioni di latte di tre individui di genotipo CSN1S1AA, CSN1S1FF e CSN1S1NN. Mediante RT-PCR sono stati amplificati i cDNA relativi ai trascritti che codificano per la proteina s1 utilizzando primer disegnati sul 1° e 19° esone. I cDNA ottenuti sono stati clonati, sottoposti a screening e sequenziati. L’analisi dei trascritti prodotti dagli alleli CSN1S1A, F e N ha messo in evidenza la formazione, oltre che di un mRNA correttamente assemblato (87,4%, 12% e 24,5%, rispettivamente), di almeno altre 4, 8 e 11 diverse popolazioni di mRNA. Le popolazioni dolete dell’allele CSN1S1A si caratterizzano per lo splicing alternativo degli esoni 13, 16 e 17, e del 1°codone dell’11°esone, mentre quelle trascritte dagli alleli CSN1S1F e N, per l’assenza dell’esone 9 e/o degli esoni 10, 11, 13, 16 e 17, oltre che del 1° codone dell’11°esone, in diverse combinazioni. In particolare per l’allele N si osserva un’incidenza maggiore dei trascritti caratterizzati da uno stop codon prematuro rispetto all’allele F (~ 30% vs 12%). L’analisi dei trascritti mette in evidenza eventi costitutivi (allele indipendente) che si realizzano durante la maturazione del pre-mRNA: rimozione casuale degli esoni 13, 16 e 17 e rimozione casuale del 1° codone dell’11° esone. Gli eventi, invece, che conducono alla sintesi di trascritti deleti degli esoni 9, 10 e 11 (prodotti dagli alleli CSN1S1 N e F) potrebbero essere la conseguenza di un delicato “meccanismo di sopravvivenza dell’mRNA” che opera nel tentativo di impedire la formazione di proteine “tronche” o inattive, attraverso la “degradazione mediata dal codone nonsenso” di mRNA che contengono stop codon prematuri, conferendo un vantaggio selettivo per la possibile traduzione di proteine parzialmente delete, potenzialmente funzionali attraverso la formazione di trascritti con delezioni che riportano in frame l’mRNA (delezione del 9° esone).
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