Messa a punto di una metodica di PCR specie specifica multiplex per una rapida ed affidabile identificazione di DNA di bufala, vacca, pecora e capra in prodotti di origine animale.

Una delle frodi alimentari più diffusa nel settore lattiero caseario è la produzione di mozzarella di bufalacampana, utilizzando latte bufalino addizionato con latte di altre specie (soprattutto quello bovino). Lametodica di analisi ufficiale per l’identificazione specie-specifica del latte utilizzato, come riportato nel“Regolamento UE No.150/2018 (i.e. focalizzazione isoelettrica), è laboriosa e presenta alcune limitazioni. Inbase a queste considerazioni ed alle ricerche bibliografiche, si è evinto che un approccio molecolare potrebbeessere utile per garantire l’autenticità dell’alimento. Attualmente esistono diverse tecniche di biologiamolecolare (Polymerase Chain Reaction (PCR), PCR-RFLP, quantitative Real Time PCR, etc), atte a rilevaree/o quantizzare la presenza di DNA di diverse specie in campioni di latte e derivati. Tuttavia, questerichiedono l’impiego di diverse reazioni di amplificazione, step aggiuntivi (digestione con enzimi direstrizione) o utilizzo di probe. L’approccio molecolare proposto ha previsto la messa a punto, attraversol’individuazione di marcatori genetici specie-specifici (delezioni/inserzioni), di una metodica di SS-PCR(Species-Specific PCR) multiplex sensibile e di rapida esecuzione, in grado di discriminare in una unicareazione l’origine del latte analizzato di bufala mediterranea, bovino, ovino e caprino. La scelta di talitipologie di mutazioni nasce dall’osservazione che, sebbene i polimorfismi a singolo nucleotide siano ifenomeni mutazionali più frequenti, meno si prestano al disegno di primer efficienti e specifici, rispetto amutazioni più complesse e stabili quali delezioni/inserzioni di più nucleotidi. Il disegno sperimentale ha previsto l’individuazione di marcatori specifici per le 4 specie (bufalamediterranea, bovina, ovina e caprina) e la messa a punto di una metodica di SS-PCR multiplex. I geniindividuati sono stati: il gene codificante la Miostatina (MSTN) per bovino, quello del recettore dellaProlattina (PRLR) per bufala mediterranea, quello della caseina αS1 (CSN1S1) per capra e quello dellacaseina αS2 (CSN1S2) per pecora. Le dimensioni degli ampliconi erano di 144 bp (PRLR); 162 bp(CSN1S2); 183 bp (CSN1S1) e 211 bp (MSTN). Lo studio ha previsto l’analisi di 20 campioni di DNA di ciascuna specie, estratti da altrettanti campioni dilatte. Il primo step ha riguardato la messa a punto di protocolli di PCR con l’utilizzo di coppie di primerspecifici per ciascuna specie, al fine di validare la specificità dei marcatori individuati. Successivamente èstato ottimizzato un protocollo di SS-PCR multiplex che ha previsto una mix delle 4 coppie di primer esoluzioni binarie e quaternarie di DNA provenienti dalle diverse specie. I risultati hanno evidenziato la capacità della metodica proposta di discriminare le quattro specie di latte traloro quando sono da sole o quando sono in miscele binarie e quaternarie. La metodica di analisi proposta è rapida, economica, di facile esecuzione e meno laboriosa rispetto agli altrimetodi. Fase successiva prevederà l’esecuzione della SS-PCR multiplex su campioni di DNA estratti damozzarella di bufala addizionati e non con latte bovino.