Il gene CFTR codifica per una proteina canale per il trasporto di cloro indispensabile per la corretta idratazione di epiteli in molti organi e tessuti. Il mal funzionamento di questa proteina è causa di Fibrosi Cistica, malattia genetica con un’incidenza di circa 1 su 3000 nati. Ad oggi, sono note più di 2000 mutazioni del gene CFTR e molte di queste alterano il corretto splicing del suo mRNA.La valutazione qualitativa dell’effetto di una variante genetica sullo splicing è una procedura semplice che mediante una RT-PCR ed una separazione elettroforetica mostra eventuali prodotti di splicing alternativi. Di contro, fare una valutazione quantitativa accurata dei prodotti di splicing, al fine di valutare la percentuale di splicing corretto residuo, richiede procedure indaginose e dispendiose. In questo lavoro mostriamo come l’utilizzo della droplet digital PCR (ddPCR) fornisce in un’unica reazione un’accurata valutazione qualitativa e quantitativa dei prodotti alternativi di splicing. In particolare, abbiamo analizzato alcuni campioni di RNA estratti da cellule di epitelio nasale prelevate direttamente da paziente con il polimorfismo T5-TG12, noto alterare lo splicing. Mediante l’utilizzo della ddPCR con tecnologia EVAGreen è stato possibile stabilire che la quota di splicing corretto risulta essere di circa il 50% rispetto al controllo. Questi dati, sebbene preliminari, indicano fortemente che utilizzando una semplice coppia di primer, senza l’utilizzo di sonde particolari, è possibile quantizzare in maniera accurata la percentuale di splicing corretto residuo. Questo è di particolare interesse, soprattutto, nell’analisi di eterozigoti compositi, in cui la mutazione di splicing è associata ad un'altra mutazione severa, e si rende necessario conoscere l’esatto contributo della variante genetica in esame sul processo di splicing. Inoltre, l’analisi del processo di splicing è fondamentale quando predetto da studi bioinformatici anche per mutazioni missense o di altro tipo, ai fini di una consulenza genetica o nella scelta di una terapia.

Analisi qualitativa e quantitativa di splicing alternativi mediante una singola reazione di droplet digital PCR / Comegna, Marika; Liguori, R.; Manzoni, F.; Di Palma, C.; Zarrilli, F.; Amato, Felice. - (2017).

Analisi qualitativa e quantitativa di splicing alternativi mediante una singola reazione di droplet digital PCR

COMEGNA, Marika;AMATO, FELICE
2017

Abstract

Il gene CFTR codifica per una proteina canale per il trasporto di cloro indispensabile per la corretta idratazione di epiteli in molti organi e tessuti. Il mal funzionamento di questa proteina è causa di Fibrosi Cistica, malattia genetica con un’incidenza di circa 1 su 3000 nati. Ad oggi, sono note più di 2000 mutazioni del gene CFTR e molte di queste alterano il corretto splicing del suo mRNA.La valutazione qualitativa dell’effetto di una variante genetica sullo splicing è una procedura semplice che mediante una RT-PCR ed una separazione elettroforetica mostra eventuali prodotti di splicing alternativi. Di contro, fare una valutazione quantitativa accurata dei prodotti di splicing, al fine di valutare la percentuale di splicing corretto residuo, richiede procedure indaginose e dispendiose. In questo lavoro mostriamo come l’utilizzo della droplet digital PCR (ddPCR) fornisce in un’unica reazione un’accurata valutazione qualitativa e quantitativa dei prodotti alternativi di splicing. In particolare, abbiamo analizzato alcuni campioni di RNA estratti da cellule di epitelio nasale prelevate direttamente da paziente con il polimorfismo T5-TG12, noto alterare lo splicing. Mediante l’utilizzo della ddPCR con tecnologia EVAGreen è stato possibile stabilire che la quota di splicing corretto risulta essere di circa il 50% rispetto al controllo. Questi dati, sebbene preliminari, indicano fortemente che utilizzando una semplice coppia di primer, senza l’utilizzo di sonde particolari, è possibile quantizzare in maniera accurata la percentuale di splicing corretto residuo. Questo è di particolare interesse, soprattutto, nell’analisi di eterozigoti compositi, in cui la mutazione di splicing è associata ad un'altra mutazione severa, e si rende necessario conoscere l’esatto contributo della variante genetica in esame sul processo di splicing. Inoltre, l’analisi del processo di splicing è fondamentale quando predetto da studi bioinformatici anche per mutazioni missense o di altro tipo, ai fini di una consulenza genetica o nella scelta di una terapia.
2017
Analisi qualitativa e quantitativa di splicing alternativi mediante una singola reazione di droplet digital PCR / Comegna, Marika; Liguori, R.; Manzoni, F.; Di Palma, C.; Zarrilli, F.; Amato, Felice. - (2017).
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11588/683779
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