Preliminare analisi strutturale ai loci ACACA e FASN nella bufala Mediterranea italiana.

Importanti funzioni nella biosintesi degli acidi grassi a catena lunga nei mammiferi sono svolte dagli enzimi ACACA e FASN. Il gene ACACA codifica per l’enzima citosolico Acetil-Coenzima-A Carbossilasi che catalizza la carbossilazione ATP-dipendente dell'acetil-CoA in malonil-CoA. Il gene FASN codifica per l’enzima multifunzionale acido grasso sintasi che catalizza la reazione di sintesi NADPH-dipendente di acido palmitico da acetil-CoA e malonil-CoA. Tali geni sono stati già investigati in altre specie di interesse zootecnico, ma nessuna informazione è attualmente disponibile per la specie bufalina. Pertanto obiettivo del lavoro è stato una preliminare analisi strutturale dei geni ACACA e FASN ed una caratterizzazione della naturale variabilità genetica a tali loci. Il DNA genomico è stato estratto da 17 campioni individuali di sangue di bufale proveniente da diversi allevamenti campani. Mediante PCR sono state amplificate e sequenziate l’esone 1, 7 e 8 per il gene ACACA e le regioni esone 6-esone 9 del gene FASN, usando primers disegnati sull’omologa sequenze bovina. Metodiche PCR-RFLP sono state sviluppate per gli SNP g.34T>C (esone 1) e g.557T>G (introne 8) rispettivamente per i geni ACACA e FASN. Per il gene ACACA è stato sequenziato un frammento di 257bp del 1°esone e 923bp appartenenti alla regione esonica 7-8. L’analisi delle sequenze di 7 individui ha messo in evidenza 1 SNP al 34°nt del 1°esone. Si tratta di una transversione T>C, che non è responsabile di alcun cambiamento aminoacidico. Per il gene FASN è stato sequenziato un frammento di ~1400bp, includente gli esoni 6-9. Dal confronto delle sequenze sono emersi 7 SNP (5 intronici e 2 esonici). Entrambe le mutazioni esoniche sono responsabili di cambiamento aminoacidico. In particolare lo SNP al 14nt dell’esone 6 (AAC>CAC) cambia Asn>His, mentre lo SNP al 16nt nell’esone 7 ACT>TCT è responsabile del cambio Thr>Ser. Sia per lo SNP trovato sul gene ACACA che per uno degli SNP messi in evidenza al locus FASN è stato possibile sviluppare un protocollo PCR-RFLP per una rapida ed economica genotipizzazione degli animali. In particolare per g.34T>C la digestione con MnlI (CCTCNNNNNNN!) ha prodotto nei campioni analizzati il seguente pattern elettroforetico: 106, 67, 43 e 41bp (omozigote T/T), il secondo contraddistinto da tre frammenti di restrizione di 147, 67 e 43bp (omozigote C/C) ed il terzo rappresentato da cinque bande: 147, 106, 67, 43 e 41bp (eterozigote T/C); mentre per lo SNP g.557T>G, il pattern di restrizione generato dall’endonucleasi TspEI (!AATT) è 1246bp (omozigote G/G), 1014 e 232bp (omozigote T/T); e 1246,1014 e 232bp (eterozigote T/G). Una genotipizzione condotta su un elevato numero di individui sottoposti a controlli funzionali sarebbe auspicabile al fine di poter utilizzare tali SNP in studi di associazione per il miglioramento delle caratteristiche quali-quantitative del grasso nel latte di bufala.