Produzione ricombinante di un mutante dell'emoglobina umana finalizzato allo stdio dell'effetto Root

L’emoglobina (Hb) rappresenta una delle proteine maggiormente studiate in termini di struttura e funzione sia per il ruolo fisiologico svolto, sia perché costituisce un modello ottimale per lo studio dei fenomeni di cooperatività. Nonostante l’elevata similitudine strutturale e funzionale tra le Hb dei mammiferi temperati e le emoglobine di pesci antartici (AFHb), esistono numerose differenze. In particolare, le AFHb presentano due effetti peculiari: l’effetto Root e la formazione dell’emicromo. L’emicromo rappresenta una specie ferrica molecolare esacoordinata a basso spin nella quale si forma un legame tra la catena laterale di un residuo distale di istidina e la sesta posizione di coordinazione del Fe3+(1). L’effetto Root invece si manifesta come una drastica riduzione dell’affinità e della cooperatività per il legame con l’ossigeno a pH acidi (2). Il requisito minimo strutturale affinchè si abbia effetto Root è la formazione, a pH acidi, di un legame a idrogeno interaspartico all’interfaccia α1β2 Asp95á-Asp101â assistito dal residuo Asp99â (3). La presenza della triade di aspartici non è però un requisito sufficiente per l’effetto Root. Infatti la variante naturale dell’Hb umana Potomac (che presenta la mutazione b101Glu→Asp e che quindi possiede la triade di aspartici) non presenta tale effetto avendo addirittura una maggiore affinità per l’ossigeno (4). Allo scopo di acquisire le informazioni necessarie per il trasferimento delle due proprietà tipiche di alcune Hb di pesci a quella umana è stato sviluppato un sistema di produzione ricombinante in E. coli della globina β nella variante naturale Potomac per consentirne un dettagliato studio strutturale. In particolare, si è affrontato il problema dell’inefficiente rimozione da parte dell’ospite batterico della metionina all’estremità N-terminale. Poiché in Hb tetrameriche il residuo N-terminale, di entrambe le catene α e β, gioca un ruolo importante nel modulare l’affinità con l’ossigeno, la mancata rimozione della Met iniziale va a modificare tale affinità. Per ovviare a questo problema è stata costruita una variante N-terminale della globina β, nella quale il residuo di Valina 1 è stato sostituito con una Metionina (β1Val→Met (1)). Per ottenere la variante Potomac è stata effettuata una mutazione a partire dal mutante 1 mediante mutagenesi sito-specifica. Il gene mutato così ottenuto è stato clonato nel vettore di espressione pET22b, generando il plasmide impiegato per trasformare un ceppo di E. coli. Sono state effettuate, quindi, le diverse prove di produzione variando la temperatura del processo ed in presenza di una concentrazione costante di induttore IPTG, di acido δ-amminolevulinico (precursore dell’eme) e di FeCl3. Analisi elettroforetica SDS-PAGE degli omogenati cellulari e delle corrispondenti frazioni insolubili ha evidenziato che la globina prodotta risulta aggregata nei corpi di inclusione dai quali è stato possibile risolubilizzarla con l’impiego di detergenti non denaturanti (5). Bibliografia: 1.Vitagliano L. et al.,(2008)J. Am. Chem. Soc. 130, 10527-35 2.Mazzarella L. et al.,(2006)Proteins: Struct. Funct. Bioinf. 65, 490-8 3.Mazzarella L. et al.,(2006)Proteins: Struct. Funct. Bioinf. 62, 316-21 4.Shih D.T. et al.,(1985)J Biol Chem. 260, 5919-24. 5.Peternel Š. et al., (2007)Biotecnnol Appl Biochem 49,239-6 Parole chiave: emoglobine, Effetto Root, produzione ricombinante Area tematica : Biologia molecolare.