Cristallizazione del colesterolo in bile umana e modello. Osservazioni in time lapse mediante video microscopia ottica

Una delle principali patologie associate alla colecisti è la calcolosi biliare. I calcoli sono prevalentemente costituiti da colesterolo (o da bilirubinato di calcio), che viene in larga misura trasportato all’interno di micelle miste o vescicole, data la sua scarsa solubilità in acqua, e precipita sotto forma di cristalli in condizioni di sovrassaturazione. Nonostante i progressi compiuti in questo campo, che includono l’identificazione di diverse sostanze che agiscono come promotori o come inibitori della formazione di calcoli, le cause ed i meccanismi della calcolosi biliare sono tuttora oggetto di ricerca. Due fattori sembrano comunque giocare un ruolo fondamentale nella patogenesi dei calcoli biliari: elevate concentrazioni di calcio e di colesterolo nella bile, ed elevati tempi di residenza della bile nella colecisti. Data la complessità del problema, un approccio di tipo multidisciplinare appare essenziale. Così, per quanto riguarda il ruolo della concentrazione di colesterolo, le condizioni di sovrassaturazione della bile sono state studiate in letteratura mediante metodi chimico-fisici, che hanno portato alla costruzione di diagrammi di fase relativi ai tre principali componenti biliari, colesterolo, sali biliari e lecitina, opportunamente discolti in soluzione salina. Utlizzando tali sistemi modello, è stato possibile identificare, negli intervalli di composizione di rilevanza fisiologica, delle regioni in cui coesistono all’equilibrio una fase solida cristallina ed una fase micellare. Questo approccio ha permesso di definire un indice di sovrassaturazione del colesterolo rispetto alle condizioni di equilibrio, e quindi un indice di litogenicità della bile. Obiettivo di questo articolo è di fornire sia una rassegna dei dati riportati in letteratura che una presentazione dei risultati ottenuti nel nostro laboratorio sulla nucleazione e cristallizzazione del colesterolo in bile modello, discutendone le possibili implicazioni biologiche. L’apparato sperimentale da noi utilizzato consiste in una stazione di video microscopia ottica con tavolo portaoggetti e messa a fuoco motorizzati. I campioni di bile vengono introdotti in un apposito incubatore da microscopio a camicia d’acqua, che consente di controllare la temperatura con elevata precisione e stabilità per periodi estesi di osservazione (la scala di tempo degli esperimenti è di alcune settimane). Le varie fasi del processo di cristallizzazione vengono seguite acquisendo periodicamente immagini dei campioni all’interno dell’incubatore. A tal fine, i campioni vengono sottoposti ad una scansione automatica mediante il sistema di posizionamente motorizzato del microscopio, che viene gestito via computer attraverso un apposito codice di controllo. Le immagini acquisite vengono convertite in formato digitale e archiviate su disco, per essere successivamente processate mediante un software di analisi dell’immagine. Questa metodologia consente di misurare la velocità di crescita e la morfologia di singoli cristalli di colesterolo in funzione del tempo.