Vitrificazione di blastocisti di buffalo (Bubalus bubalis) prodotte in vitro mediante cryotop: confronto di due procedure.

Lo scopo di questo lavoro è stato quello di comparare l’efficienza di due metodi di vitrificazione mediante Cryotop (1) per embrioni di bufalo prodotti in vitro. Un totale di 63 blastocisti (Bl) ottenute in vitro (2) sono state vitrificate al giorno 7 di coltura (giorno 0= fecondazione). Con il metodo A, le Bl (n. 29) sono state esposte a 3 soluzioni di vitrificazione (SV1, SV2 e SV3) e a 2 di riscaldamento impiegate precedentemente nel nostro laboratorio ricorrendo alle tradizionali paillette (3). In particolare sono state utilizzate concentrazioni crescenti di crioprotettori in una soluzione base di PBS + 20 % di siero fetale bovino (FCS): 1.4 M di glicerolo (SV1), 3.6 M di glicole etilenico (GE) + 1.4 M di glicerolo (SV2) e 4.6 M di GE + 3.4 M di glicerolo (SV3). Con l’ausilio di una pipetta a bocca gli embrioni sono stati collocati sull’estremità del Cryotop e direttamente immersi in azoto liquido; al riscaldamento sono stati posti prima in saccarosio allo 0.5 M, poi in saccarosio allo 0.25 M ed infine in medium SOF (4) per 24 h. Con il metodo B, le Bl (n. 34) sono state trattate con soluzioni di vitrificazione e di riscaldamento precedentemente utilizzate per embrioni di bovino in Open Pulled Straw (5). Sono state impiegate per la vitrificazione 2 soluzioni allestite a partire da una soluzione base di TCM 199 + 20% di FCS, contenenti la prima 7.5% di dimetilsulfossido (DMSO) + 7.5% di GE e la seconda 0.5 M di saccarosio + 16.5% di GE + 16.5% di DMSO. Il riscaldamento è stato fatto immergendo l’estremità del Cryotop in una soluzione 0.25 M di saccarosio e gli embrioni recuperati sono stati posti in una soluzione 0.15 M di saccarosio e successivamente in medium SOF per 24 h. Dopo 24 ore di coltura in vitro è stata valutata la vitalità embrionale basandosi su parametri quali ripristino della morfologia embrionale e riespansione della cavità blastocelica. Le differenze tra le percentuali di sopravvivenza sono state analizzate mediante il test del Chi-Quadrato. Dall’analisi dei dati è emerso che la percentuale di sopravvivenza di blastocisti vitrificate-riscaldate con il metodo B (64.7%) è stata maggiore (P<0.01) di quella riscontrata con il metodo A (31 %). Questi dati preliminari indicano che il metodo B offre incoraggianti prospettive per la crioconservazione di embrioni di bufalo prodotti in vitro.