Sviluppo di tecniche di microscopia time-lapse per studio del ruolo dell'NG2 nel controllo della motilità cellulare.

La motilità cellulare è alla base di numerosi processi biologici, dalla morfogenesi all'infiammazione. Per lo studio in 2D del fenomeno sono disponibili tecniche di microscopia in fluorescenza su campioni fissati, in cui le cellule vengono osservate in istanti di tempi precedenti o seccessivi all'aggiunta di un dato fattore, perdendo la dinamicità dell'evento. L'avvento di tecnologie come la microscopia time-lapse ha permesso di superare tali limiti, consentendo di seguire il movimento istante per istante e di ottenere una quantizzazione del fenomeno in termini di analisi dello spostamento delle cellule. I metodi sperimentali per lo studio della chemiotassi si possono raggruppare in due categorie principali: saggi di tipo indiretto, in cui si registra la posizione finale delle cellule dopo un assegnato periodo di incubazione, e saggi di tipo diretto, in cui le traiettorie di singole cellule vengono monitorate nel corso dell'esperimento . Alla prima categoria appartiene il saggio di Boyden, in cui il comportamento chemotattico viene quantificato contando il numero di cellule che hanno attraversato un filtro interposto tra due compartimenti in risposta ad un gradiente di concentrazione. Un altro saggio indiretto per lo studio della migrazione sotto l'effetto del gradiente di concentrazione, è l' under-agarose, in cui vengono praticati dei pozzetti in un gel di agarosio, alcuni dei quali contenengono la sospensione di cellule, altri la soluzione del fattore chemottatico. Uno dei principali saggi diretti per visualizzare il movimento di singole cellule in un ambiente 3D è lo studio della migrazione in gel di collagene o fibrina. Le tecniche quantitative in uso per la caratterizzazione della motilità cellulare in 2D o 3D includono in primo luogo la ricostruzione delle traiettorie cellulari. Per la ricostruzione delle traiettorie è necessario associare le posizioni successivamente occupate dalle singole cellule applicando un algoritmo di "matching". Il contributo principale dell'Unità di ricerca di Napoli consisterà nella messa a punto di tecniche e di metodi di analisi per lo studio della motilità cellulare in 2D e 3D in vitro. Gli aspetti del progetto saranno: 1) Realizzazione di un sistema sperimentale per lo studio del movimento in 2D di cellule della muscolatura liscia derivanti da topi wild-type e topi NG2 knock-out in risposta a singole molecole ECM purificate e matrici native (isolate da cellule coltivate secondo uno specifico protocollo). La motilità cellulare verrà studiata utilizzando un sistema di video microscopia ottica basato su un microscopio ottico rovesciato fornito di un tavolo porta oggetto e di un sistema di messa a fuoco dotati entrambi di motori passo-passo, che consentono di posizionare in modo automatico il campo di vista all'interno del campione in esame. Le immagini vengono acquisite mediante una videocamera monocromatica CCD ed inviate ad un personal computer. 2) Misure di migrazione 2D di cellule trasformate del tipo muscolatura liscia (di fatto cellule di leiomiosarcoma) in cui sono state separate le sottopopolazioni NG2+ e NG2-. Le misure di migrazione in 2D di cellule della muscolatura liscia verranno condotte sviluppando un'analisi quantitativa del comportamento locomotorio delle cellule, basata sulle loro traiettorie durante gli esperimenti di time-lapse. La ricostruzione delle traiettorie tridimensionali verrà effettuata mediante degli algoritmi di matching a partire dalle coordinate delle cellule negli esperimenti di time-lapse. 3) Analisi comparativa in 2D delle cellule descritte qui sopra nelle quali siano stati stabilmente trasfettati vari costrutti di delezione dell'NG2. L'analisi sarà basata su alcuni parametri caratteristici della motilità, quali il coefficiente di diffusione ed il tempo di persistenza. Tali parametri verranno calcolati dagli spostamenti quadratici relativi a ciascuna traiettoria, dei quali sarà determinato il valore medio sulla popolazione di cellule in esame in funzione del tempo e confrontato con modelli di correlated random walk. 4) Realizzazione di un sistema sperimentale per lo studio della chemiotassi in un gel di collagene. Il sistema da sviluppare per lo studio della chemiotassi si basa sull'osservazione diretta della locomozione cellulare 3D in esperimenti di time-lapse. Il saggio di migrazione verrà effettuato in una cella rettangolare divisa in due comparti da un setto separatore. Le immagini acquisite mediante scansione tridimensionale del gel di collagene saranno sottoposte ad elaborazione al calcolatore utilizzando algoritmi di deconvoluzione per la rimozione delle componenti fuori fuoco. L'implementazione degli algoritmi di deconvoluzione sarà effettuata in ambienti di calcolo ad alte prestazioni.