Identification of Erbin interlinking MuSK and ErbB2 and its impact on acetylcholine receptor aggregation at the neuromuscular junction

Il progetto di ricerca su cui ho svolto i miei studi è iniziato con lo scopo di individuare nuovi interattori di MuSK ed è proseguito con la caratterizzazione dei meccanismi in cui sono coinvolti. MuSK è un recettore tirosina chinasi, espresso nelle fibre muscolari, nelle quali regola lo sviluppo della giunzione neuromuscolare. Studi pubblicati negli ultimi anni, hanno dimostrato che MuSK non è coinvolto solo nella formazione iniziale della giunzione neuromuscolare, ma anche nel mantenimento dell’apparato postsinaptico e nel controllo della crescita assonale. La giunzione neuromuscolare trasmette segnali dai motoneuroni alle fibre muscolari multinucleate. Un fenomeno che caratterizza l’apparato postsinaptico, è l’aggregazione dei recettori dell’acetilcolina (AChR) (Sanes and Lichtman, 1999). Solo i nuclei muscolari a diretto contatto con la sinapsi, trascrivono i geni codificanti per le subunità del AChR (Merlie and Sanes, 1985). Normalmente, l’aggregazione degli AChRs, è indotta dalla proteina agrina, secreta dai motoneuroni, e dalle neoreguline. Studi dimostrano che queste ultime stimolano la trascrizione dei geni dell’AChR (Falls et al., 1993). Esperimenti recenti indicano, comunque, che le neureguline non sono essenziali per la trascrizione sinapsi-specifica dei geni delle subunità del recettore, perché, in topi mancanti di ErbB2 ed ErbB4, selettivamente nel muscolo scheletrico, ed in quelli mancanti della neuregulina nei motoneuroni e nelle fibre muscolari, sono stati riscontrati fenotipi modesti o del tutto normali (Escher et al., 2005; Jaworski e Burden, 2006). Altri dati suggeriscono che il ruolo primario delle neureguline, nell’apparato postsinaptico, consiste nella regolazione dell’aggregazione e nella migrazione degli AChRs sulla superficie cellulare (Ponomareva et al., 2006). Le neureguline attivano i recettori tirosina chinasi della famiglia del recettore EGF (ErbBs). L’eterodimero ErbB2/4 è il recettore con maggiore funzionalità nell’apparato postsinaptico (Trinidad et al., 2000). Le proteine ErbB sono concentrate al sito postsinaptico della giunzione neuromuscolare (Altiok et al., 1995; Moscoso et al., 1995; Zhu et al., 1995; Trinidad et al., 2000) o nel sistema nervoso centrale (Garcia et al., 2000; Huang et al., 2000). La localizzazione sinaptica di ErbB4 nel sistema nervoso centrale, è mediata da un’interazione del suo dominio carbossi–terminale con il dominio PDZ della proteina PSD-95 (Postsynaptic Density Protein) (Garcia et al., 2000; Huang et al., 2000). Al contrario, PSD-95, interagisce debolmente o per niente, con ErbB2 ed ErbB3. Un’altra proteina contenente un dominio PDZ, Erbin, interagisce specificatamente con ErbB2 (Borg et al., 2000; Huang et al., 2001). Erbin è la capostipite di una famiglia di proteine denominata LAP (Leucine-rich-repeats and PDZ domain), caratterizzate da 16 ripetizioni “leucine-rich” (LRR) nella porzione amino-terminale e da 1 a 4 domini PDZ in quella carbossi–terminale (Borg et al., 2000). Tutte le proteine della famiglia LAP sono coinvolte nella determinazione della polarità cellulare (Bryant e Huwe, 2000; Kolch, 2003). Di recente è stato dimostrato che, il dominio tra la LRR e il PDZ di Erbin, interagisce con EBP50 (Rangwala et al., 2005) e Smad3 (Dai et al., 2007). Il ruolo e le interazioni molecolari di Erbin nella giunzione neuromuscolare, non sono stati ancora studiati. In questo studio noi dimostriamo (1) che Erbin è localizzata alla giunzione neuromuscolare, (2) interazioni di Erbin con il recettore tirosina kinasi MuSK, che media l’azione dell’ agrina, come principale regolatore della formazione dell’apparato postsinaptico, e con ErbB2, (3) che il dominio di Erbin interagente con MuSK, si sovrappone al dominio interagente con Smad3, (4) che Erbin o MuSk, attenuano la trascrizione mediata da Smad3. Tre diverse isoforme (splice variants) di Erbin sono state identificate in cellule muscolari, tutte contenenti il dominio di interazione con MuSK. Esperimenti di knockdown in cellule muscolari, attribuiscono ad Erbin un ruolo nel controllo della densità di aggregati di recettori dell’acetilcolina. In aggiunta ad Erbin, altre proteine della famiglia LAP sono state individuate nella giunzione neuromuscolare: Lano e Scribble. Il rate di trascrizione dei geni codificanti per queste 2 proteine, aumenta quando i mioblasti differenziano in miotubi. Il nostro scopo era di identificare, tramite yeast-two-hybrid screening, nuove proteine interagenti con il dominio intracellulare di MuSK. Per questo, abbiamo fuso 2 parti del dominio intracellulare del recettore (MuSK2xWT), creando così un dimero che somigliasse il più possibile al dimero di MuSK, conformazione attiva in vivo (Cheusova et al., 2006). Un secondo costrutto è stato generato allo stesso modo, ma per una variante di MuSK priva di attività chinasica, per capire se il legame con altre proteine fosse dipendente dalla fosforilazione del dominio intracellulare. L’espressione di questi costrutti, la loro funzionalità e la loro applicabilità allo screening, sono stati descritti precedentemente (Cheusova et al., 2006). Tra i cloni identificati, 2 consistevano della porzione carbossi-terminale dal residuo aminoacidico 1007 fino al codone di stop della isoforma umana di Erbin (hErbin-ND- 1007), proteina della famiglia LAP. Nell’uomo, sono state descritte diverse varianti di Erbin. Quella da noi identificata corrisponde alla porzione carbossi-terminale della variante 2 (hErbin-V2). La stessa interazione si è osservata anche con la variante di MuSK priva di attività chinasica. Per confermare l’interazione con altri approcci sperimentali, abbiamo effettuato una transfezione transiente di cellule HEK293 dei vettori di espressione per Erbin, MuSK2xWT e la variante con inattivazione del dominio kinasico, gli ultimi 2 contenenti una T7-tag. Immunoprecipitati degli estratti proteici hanno confermato i dati precedentemente ottenuti. Per determinare se l’interazione fosse facilitata dall’over-espressione delle proteine, abbiamo effettuato immunoprecipitati da estratti proteici di una linea di cellule muscolari (C2C12) e da muscolo scheletrico (Gastrocnemius) murino. In queste condizioni, dove sia Erbin che MuSK sono endogenamente espressi allo stesso livello, è stato ancora possibile co-precipitare entrambe con i rispettivi partners. Poiché Erbin e MuSK interagiscono fisicamente, abbiamo voluto determinare il profilo di espressione di Erbin nelle regioni sinaptiche e post-sinaptiche. Attraverso RT-PCR abbiamo misurato la quantità di transcritto di Erbin e l’abbiamo paragonato a quello di proteine concentrate normalmente alla giunzione neuromuscolare (MuSK, AChR). L’RNA totale è stato estratto dalla regione sinaptica e quella extra-sinaptica del diaframma di topo. Come previsto, sia MuSK che AChR erano altamente espressi a livello della regione sinaptica, così come Erbin. L’espressione del transcritto di Erbin a livello sinaptico, è stata confermata anche da ibridazione in sito su diaframmi di topi. Il nostro obiettivo successivo era quello di dimostrare la localizzazione di Erbin nell’apparato postsinaptico. Attraverso tecniche di immunoistochimica su sezioni trasversali dei muscoli gastrocnemius e soleus (zampe posteriori) di topo, abbiamo osservato un’accumulo significativo di Erbin alla giunzione neuromuscolare, dove colocalizzava con i recettori dell’acetilcolina. Per identificare gli epitopi di MuSK ed Erbin che interagiscono tra loro, abbiamo usato una serie di mutanti di MuSK con delezioni nella porzione carbossi–terminale. Dapprima, nello screening yeast-two-hybrid, abbiamo osservato che i lieviti crescevano solo quando hErbin-N_-1007 era usata come “esca” con i vettori “preda” contenenti i costrutti MuSK-515-868 e MuSK-515-857, che comprendono il dominio intracellulare di MuSK e il dominio chinasico, rispettivamente. Tramite esperimenti di GST pull down, l’interazione osservata con i lieviti, ha avuto un’ulteriore conferma. Il passo seguente è stato quello di procedere all’identificazione del dominio di hErbin- NΔ-1007, interagente con MuSK. Anche in questo caso sono stati generati diversi mutanti, tramite delezioni, sia nella porzione amino-terminale, che in quella carbossiterminale. Solo i lieviti contenenti il frammento con delezione fino al residuo aminoacidico 1200 (hErbin-NΔ-1200), come hErbin-PDZ (hErbin-NΔ-1261), crescevano su terreno selettivo. In caso di delezioni nella parte carbossi-terminale, riuscivano a crescere solo i lieviti contenenti Erbin dal residuo aminoacidico 1007 fino al 1266 (hErbin-ΔPDZ) o 1204 (hErbin-1007-1204). Gli epitopi identificati sono stati verificati anche in esperimenti di GST pull down. Avendo dimostrato che Erbin interagisce con MuSK, collegando quindi MuSK con ErbB2, abbiamo voluto investigare il significato biologico di questa interazione. L’approccio usato, è consistito nello studiare se l’ablazione o l’over-espressione di Erbin avesse una conseguenza sull’aggregazione dei recettori dell’acetilcolina. Per questo abbiamo clonato diversi vettori codificanti per shRNA, e testato la loro efficienza nel diminuire l’espressione dei trascritti di Erbin. Ciò è stato fatto sia mediante saggi di luciferasi, sia mediante western blot su lisati proteici di HEK293, transfettate con gli shRNAs. Allo scopo di analizzare l’effetto del knockdown di Erbin sugli aggregati, abbiamo transfettato cellule C2C12 con Erbin shRNA. Dopo aver stimolato l’aggregazione dei recettori, tramite aggiunta di agrina nel mezzo di coltura, abbiamo incubato le cellule con la bungarotossina coniugata alla rodamina. Grazie all’alta affinità di legame della tossina verso la subunità alfa dei recettori, è possibile osservarli tramite fluorescenza. Livelli minori del trascritto di Erbin riducono significativamente la densità dei recettori. L’analisi della densità è stata effettuata tramite microscopia confocale. Di recente è stato dimostrato che Erbin inibisce la cascata di segnali di TGF-β attraverso un dominio interagente con Smad (Dai et al., 2007). Era di nostro interesse sapere se le cellule C2C12 esprimessero TGF-β e Smad, e se questo accadesse in dipendenza o meno dall’agrina. Tramite RT-PCR abbiamo dimostrato l’espressione dei recettori TGF- β RI e TGF- β RII e Smad3 nelle cellule muscolari. Per identificare il ruolo di Erbin e MuSK nel signaling di TGF- β abbiamo transfettato C2C12 con un vettore di espressione codificante per Smad3. Abbiamo osservato, come riportato in letteratura (Liu et al., 2001) che questa proteina inibiva la differenziazione dei mioblasti in miotubi. Noi dimostriamo che, la co-transfezione di Smad3 con hErbin-v2, blocca l’inibizione e i mioblasti riescono a differenziarsi nuovamente. Per identificare la presenza di altre proteine della famiglia LAP in cellule muscolari, abbiamo eseguito esperimenti di RT-PCR su mioblasti e miotubi C2C12. Abbiamo così individuato la presenza di Scribble e Lano. Un altro dato interessante è che l’espressione di Scribble è di gran lunga maggiore di quella di Lano e si osserva un suo ulteriore aumento dopo stimolazione dell’aggregazione dei recettori, tramite agrina. Al momento è in corso lo studio dell’effetto che il knockdown di Scribble e Lano, anche in combinazione con quello di Erbin, ha sulla densità degli aggregati dei recettori. Stiamo valutando gli stessi effetti anche su colture primarie di muscolo scheletrico, a seguito del knockdown delle suddette proteine. I nostri dati dimostrano per la prima volta un’interazione tra Erbin e MuSK a livello della giunzione neuromuscolare e presentano un inizio per un approfondimento del ruolo delle proteine LAP nell’apparato postsinaptico. L’identificazione di interazione tra proteine è un prerequisito per lo studio di meccanismi di signaling. Lo stato dell’arte riguardante la trasduzione del segnale della giunzione neuromuscolare è molto limitato. L’identificazione di interazioni alla giunzione, può dare la possibilità di conoscere meglio lo sviluppo e le patologie della sinapsi. Per esempio, dati recenti riguardo l’interazione tra MuSK e la porzione C-terminale di Co1Q, una “coda” collagenica che trasporta l’Acetilcolinesterasi alla giunzione neuromuscolare, hanno dimostrato che MuSK è responsabile della localizzazione sinaptica dell’esterasi, ed hanno dato spiegazioni per certe forme di sindromi di miastenia congenita, associate con mutazioni nella parte C-terminale di Co1Q (Engel et al., 2003).